有機磷酸酯類農(nóng)藥降解菌的分離及其降解基因的克隆.pdf

1、有機磷酸酯類農(nóng)藥多為廣譜、高效、劇毒的殺蟲劑。我國農(nóng)村的廣泛、長期的使用導致的高殘留對生態(tài)環(huán)境和人類的食品安全已構成了巨大的威脅。 土壤微生物對農(nóng)藥的分解能消除農(nóng)藥的殘留，減小農(nóng)藥對生態(tài)系統(tǒng)的影響。本實驗設計研究了此類農(nóng)藥的微生物降解特性，意在克隆出降解農(nóng)藥的基因，并應用于田間農(nóng)業(yè)作物，將有效地解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中有機磷酸酯類農(nóng)藥殘留問題，為農(nóng)業(yè)無公害生產(chǎn)提供新途徑。 本課題研究主要包括兩大方面：（1）有機磷酸酯類農(nóng)藥降解

2、菌的分離及其降解特性的初步研究。馴化富集培養(yǎng)分離到三株能以樂果（dimethoate）、敵敵畏（dichlorvos）有機磷酸酯類農(nóng)藥為唯一碳源的菌株X1、X2、X3。其中X2為革蘭氏陽性菌，其余兩株均為革蘭氏陰性菌，。由于目前研究的能夠降解農(nóng)藥的微生物大多數(shù)為革蘭氏陰性菌，革蘭氏陽性菌較為少見，故選用X2作為實驗材料。根據(jù)生理生化鑒定和16S rDNA測序分析將X2鑒定為黃色節(jié)桿菌（Arthrobacter flavescens）。高

3、效液相色譜（HPLC）測定結果表明，此菌株在72小時內對800mg/L的樂果，500 mg/L敵敵畏的降解率分別為88.11％和96.32％。該菌最適生長溫度為28℃，最適pH為7.0，對樂果和敵敵畏的最高耐受濃度分別為1600 mg/L和800mg/L。X2對有機磷酸酯類農(nóng)藥有明顯的降解作用，但對于非磷酸酯類農(nóng)藥草甘膦無降解作用。對菌株進行質粒抽提和大質?？鞕z，結果表明該菌無質粒存在。 （2）克隆降解有機磷酸酯類農(nóng)藥的基因。用

4、鳥槍法克隆降解磷酸酯類農(nóng)藥的基因。將X2總DNA用限制性核酸內切酶BamHI完全酶切后回收2-5Kb的片段，連接到載體pBluescript KS上，轉化大腸桿菌E.coli DH5α，用含樂果800 mg/L，Amp100μg/ml的平板篩選陽性克隆。獲得三株陽性克隆EpKS-B1、EpKS-B2和EpKS-B3，將得到的陽性克隆抽質粒進行瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)重組質粒大小均一樣，然后進一步進行酶切驗證。連接在載體上的目的基因片段大