久效磷降解菌的分離、鑒定及降解酶基因的克隆.pdf

1、久效磷是一類劇毒有機磷殺蟲劑，現(xiàn)已被許多國家禁用或限用，且被列入PIC(Prior Informed Consent，預先通知同意)公約。但由于該類農(nóng)藥殺蟲效果好、見效快且價格便宜，在我國此類農(nóng)藥禁而不止的現(xiàn)象十分嚴重，由此引發(fā)的環(huán)境污染問題日益突出。有機磷化合物在環(huán)境中的歸趨主要是通過微生物降解和轉(zhuǎn)化。環(huán)境污染的微生物修復具有其它修復方法無可比擬的優(yōu)勢，因此如何開發(fā)利用參與環(huán)境凈化的微生物資源，進一步充分有效地發(fā)揮其潛在的修復環(huán)境污染

2、的能力，已成為人類生產(chǎn)活動中的重要課題。本研究的意義在于分離、篩選能夠以久效磷作為唯一碳源生長的降解菌株，并對該菌株在各種環(huán)境條件下降解久效磷的特性進行研究，以期為久效磷環(huán)境污染的修復工作提供科學依據(jù)；同時對其降解酶基因進行克隆，為進一步研究其降解機制、構(gòu)建具有更強降解能力的基因工程菌奠定基礎(chǔ)。 從久效磷生產(chǎn)企業(yè)曝氣池的底層污泥中分離篩選到一株久效磷降解細菌，編號為M-1，該菌能以久效磷作為唯一碳、氮源但不能作為唯一磷源生長。經(jīng)

3、過對其形態(tài)特征、生理生化、16s rDNA序列以及DNA-DNA分子雜交分析，該菌株初步鑒定為Paracoccus versutus。M-1最適生長溫度為30℃，最適生長初始pH為8.0，該菌對濃度為3％NaCl敏感，對慶大霉素、壯觀霉素有拮抗作用，堿裂解法能夠有效提取M-1質(zhì)粒。 M-1在好氧及厭氧條件下能夠以久效磷作為唯一碳源生長，其對久效磷的最高耐受濃度為2500mg·L<'-1>，最適生長濃度為300mg·L<'-1>；

4、M-1生長和降解久效磷的最適接種量為3％，溫度為30℃，pH為7.5，裝液量為100/250mL，NaCl濃度為0-0.05％。M-1能夠降解其他有機磷化合物敵敵畏和磷胺，而對甲基1605沒有降解效果；此外，M-1能夠水解TpNPP(對硝基苯磷酸二鈉鹽)產(chǎn)生黃色pNP(對硝基苯酚)，通過比色法測定反應(yīng)體系對硝基苯酚的增加量對磷酸酯酶的定域表達進行研究，結(jié)果表明：膜結(jié)合酶的磷酸酯酶活性最低，分別為粗酶液、胞內(nèi)酶以及菌懸液磷酸酯酶活性的11

5、.85％、10.77％和23.15％，由此推測M-1所具有的磷酸酯酶為胞內(nèi)酶。上述結(jié)果亦表明M-1主要是通過磷酸酯鍵的水解從而降解一系列的有機磷化合物。 潮土和高沙土中的土著微生物能夠促進土壤久效磷農(nóng)藥的降解，但久效磷在紅壤中的微生物降解效果較差。接種降解菌Paracoccus versutus M-1于滅菌或新鮮潮土和高沙土中均能極顯著提高久效磷農(nóng)藥的降解效率，但在紅壤相同處理中卻無降解效果。M-1在淹水狀態(tài)和非淹水狀態(tài)下均能

6、迅速降解潮土中的久效磷殘留，但久效磷在淹水狀態(tài)下的降解效率顯著高于非淹水狀態(tài)。 M-1在加富培養(yǎng)基中生長和降解敵稗的最佳接種量為3％，最適pH為7.5，最適溫度為30℃。接種M-1 72h后，敵稗和丁草胺基本完全降解，乙草胺和丙草胺的降解效率分別為90.03％、78.76％；無機鹽培養(yǎng)基中，敵稗、乙草胺、丙草胺、丁草胺的降解效率分別為48.55％、38.37％、51.73％和43.77％。通過HPLC檢測發(fā)現(xiàn)：接種M-1于含有40mg·

7、L<'-1>敵稗的加富培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)基中敵稗含量的逐漸下降，發(fā)現(xiàn)在T=3.807處有一代謝底物峰的積累，此代謝物的保留時間與3，4-二氯苯胺一致；丁草胺降解過程中，保留時間為3.623處亦檢測到一個未知化合物的積累，由此推測M-1主要通過酰胺鍵的斷裂從而降解一系列的酰胺類化合物。以敵稗作為反應(yīng)底物，通過HPLC測定反應(yīng)體系3，4-二氯苯胺的增加量對降解酶的表達特性進行分析，結(jié)果表明：M-1的胞內(nèi)酶降解敵稗的活性最高，為胞外酶活性的4

8、6.15倍，而周質(zhì)酶未檢測到酶活；敵稗作為誘導劑對M-1酰胺酶活性沒有顯著影響。M-1在潮土中20d對15mg/kg敵稗的降解效率為70.82％。 以紫外掃描測定反應(yīng)體系久效磷的減少量為依據(jù)，建立了久效磷降解酶的酶促反應(yīng)體系。久效磷降解酶的定域試驗表明該酶存在于M-1細胞內(nèi)，組成表達。最適產(chǎn)酶碳、氮源分別為葡萄糖和硝酸銨。久效磷降解酶的最適反應(yīng)溫度為25℃，pH為8.0；久效磷降解酶在溫度低于30℃，pH高于7.0穩(wěn)定表達。粗酶

9、液的V<,max>為131.58μmol·min<'-1>，K<,m>為0.29μmol·min<'-1>，最大降解速率為682.12μmol·(min·mg)<'-1>。 M-1能夠降解一系列的磷酸酯類化合物以及酰胺類化合物，且降解酶均位于M-1的胞內(nèi)，組成表達。這表明Paracoccus versutus M-1降解久效磷的代謝途徑可能與已報導的Arthrobacter atrocyaneus和Bacillus megate

10、rium MCM B-423相同。 通過吖啶橙法、SDS法、紫外線照射法、溴化乙錠法、高溫法、凍融法以及連續(xù)傳代法對M-1的質(zhì)粒進行消除，結(jié)果表明高溫法能夠有效消除M-1的一個質(zhì)粒，而對M-1的其它質(zhì)粒沒有消除效果。 通過轉(zhuǎn)座子插入突變法把自殺性質(zhì)粒pSC123中的轉(zhuǎn)座子插入到久效磷降解菌M-1的基因組中，以M-1能夠利用久效磷作為唯一碳、氮源生長為篩選依據(jù)，經(jīng)過初篩和復篩獲得了4株完全喪失降解久效磷功能的插入突變子，編

11、號為A12、G31、M25、X8。通過SEFA-PCR方法對插入位點兩側(cè)序列進行擴增，把擴增序列進行拼接，得到一條長度為6919bp的片斷。此片斷包含4個閱讀框，G31和A12插入位點位于aac3和deh。Aac3 的核酸序列與Xanthobacter autotrophicus 的 dhlB(the haloacid dehalogenase，脫鹵基因)基因的同源性為88％，與Xanthobacter，flavus的dhlA(the

12、haloalkane dehalogenase gene，環(huán)烷烴脫鹵基因)基因的同源性為88％，與Serratia marcescens N-乙酰胺轉(zhuǎn)移酶基因(aac3-vb)的同源性為89％；氨基酸同源性分析表明deh具有功能蛋白信息，其與Bacillus sp.NRRL B-14911中短鏈脫氫酶具有48％的同源性，與Pseudomonas aeruginosa UCBPP-PA14中短鏈乙醇脫氫酶具有44％的同源性。通過互補表達策