節(jié)桿菌(arthrobactersp.)產(chǎn)β半乳糖苷酶的研究

1、江南大學(xué)碩士學(xué)位論文節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）產(chǎn)β-半乳糖苷酶的研究姓名：孫慧慧申請學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：唐蕾20090801A b s t r a c tA b s t r a c t1 3 - g a l a c t o s i d a s eh a d t h et w oc a t a l y t i ca c t i v i t ya tt h es a m et i m e ，o

2、n ew a s t h eh y d r o l y s i sa n dt h e o t h e rw a st h et r a n s f e r ．I t h y d r o l y z e d l a c t o s e i n t o g l u c o s ea n dg a l a c t o s e ，w i t ht h ea d d i t i o no f f r u c t o s e ，l a c t u

3、 l o s e s w e r ef o r m e db yf r u c t o s et r a n s f e r r e dt og a l a c t o s e ．B e c a u s eo ft h e s e t w o f u c t i o n s ，t h e y d e t e r m i n e d t h e m a i n u s e o f I B - g a l a c t o s i d a s

4、 e i n i n d u s t r y ：( 1 )h y d r o l y z e d t h e l a c t o s e i n m i l k ，s o l v e d t h ep r o b l e ml a c t o s e i n t o l e r a n e ；( 2 ) p r o d u c e dt h el a c t u l o s e b y b i o c a t a l y s i s p

5、 r o c e s s ．O n e b a c t e r i u m s t r a i n A r t h r o b a c t e r Z 2 1 p r o d u c i n g1 3 - g a l a c t o s i d a s e w i t ht r a n s g l y c o s y l a t i o n a c t i v i t y w a ss c r e e n e di n t h ep a

6、 s tt i m e ．，n I e m a j o rr e s u l t s o f t h i sp r e l i m i n a r y s t u d y w e r e p r e s e n t e da sf o l l o w ：W h e nt h el a c t o s ea n d f r u c t o s ec o n c e n t r a t i o n sw e r e2 ．5 ％a n d 1

7、 ．2 5 ％r e s p e c t i v e l yi nt r a n s g l y c o s y l a t i o nr e a t i o n ，t h e a c t i v i t y o f1 3 - g a l a c t o s i d a s ew a s2 ．4 U ／m L ( 1 a c t o s e ) ．L a c t u l o s e sW a sd e c t e t e dw i t

8、ht h ep r o d u c t i o no f15 g ／La n dh a da h i 【g h p u r i t y ．T h e1 3 - g a l a c t o s i d a s eC a nh y d r o l y z e9 0 ％l a c t o s ei nm i l k ，a tt h e4 0 。C f o r5h ，w i t ht h e1 3 - g a l a c t o s i d a

9、 s eq u a n t i t yw a g1 ．2 2 U ／m L ( 1 a c t o s e ) ．B u t o n l y h y d r o l y z e d 6 5 ％l a c t o s e i n m i l k a t t h e4 ℃f o r 10 h ．1 3 - g a l a c t o s i d a s e f r o m A r t h r o b a c t e r Z 2 1h a d

10、t h e t r a n s g l y c o s y l a t i o n a c t i v i t y a n dh y d r o l y s i sa c t i v i t y i nl o w t e m p e r a t u r e ，t h e t r a i tW a s v a l u a b l ef o r i n d u s t r ya p p l i c a t i o n ．T h r o u

11、g h n a t i v e - P A G E ( n a t i v ep o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ) ，1 3 - g a l a c t o s i d a s ef r o mA r t h r o b a c t e r Z 2 1 h a dt h r e ei s o z y m e s ，t h ei s o z y m

12、e ⅡW a ge x p r e s s e dc o n s t i t u t i v e l y , a n dw a sn o ti n d u c db yl a c t o s e ．t h ei s o z y m e I a n d1 1 1 w e r ee x p r e s s e db y1 a c t o s ei n d u c e d ．T h er e s u l t sm a d e a f o u

13、n d a t i o n f o r1 3 - g a l a c t o s i d a s ep u r i f i c a t i o na n d g e n e c l o n i n ga n d e x p r e s s i o n ．A m u t a n tM 2W a sa b t a i n e db yt r e a t i n gZ 2 1w i t hU V1 3 - g a l a c t o s i

14、d a s ea c t i v i t yW a s0 ．8 9t i m e sa st h a tf r o mo r i g i n a l s t r a i n ．T h ep r o d u c t i o no f l a c t u l o s e sw a s i n c r e a s e dt o 3 0g ／L t h a tw a s 1 ．4 t i m e s a s t h a t f r o m A

15、r t h r o b a c t e r Z 2 1 ．T h e o p t i m i z e d f e r m e n t a t i o n m e d i u m o fA r t h r o b a c t e rM 2c o n t a i n e d ( g ／L ) ：l a c t o s e 10 ，c o r nl i q u o r2 2 ，F(xiàn) e J ’‘1 ．5m m o L ／L ，p H 7 ．0

16、．T h e1 3 - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y W a si n c r e a s e d 2 ．7 6 t i m e s f r o m 0 ．4 6 5 U ／m L ( O N P G ) t o 1 ．8 7 5U ／m L ( O N P G ) a f t e ro p t i m i z a t i o n ．p —g a l a c t o s i d a

17、s ef i ' o mt h e m u t a n ts t r a i nM 2h a dt h eg o o dc h a r a c t e r t h a tt e m p e r a t u r e s t a b i l i t ya n d p H s t a b i l i t yW a sb e t t e rt h a n t h a tf r o mo r i g i n a ls t r a i n

18、．I fi t W a si n ac e r t a i nt e m p e r a t u r e a n dp Hc o n d i t i o n ，t h e a c t i v i t y o fp - g a l a c t o s i d a s e d i dn o tf l u c t u a t e a c u t e l y ．1 3 ·g a l a c t o s i d a s e f r o

19、m b o t h t h e o r i g i n a l s u a i n a n d m u t a t i o n s 廿a i n c o u l db ea c t i v a t e d b y M n 2 + a n d M 9 2 + , a n di tw a s s t r o n g l yi n h i b i t e d b y C u 計(jì)．I no r d e rt o c l o n e t h eg

20、 e n e o f 1 3 - g a l a c t o s i d a s e ，t h em e t h o d s o f g e n o m i c D N A e x t r a c t i o nf r o mA r t h r o b a c t e rs p w e r er e s e a r c h e di n t h i s p a p e r ．T h er e p e a t e d l yc h i l

21、 l e d g r i n d i n g a n dt o l u e n et r e a t m e n t st ot h ec e l l s w e r e u s e dr e s p e c t i v e l yb e f o r eC T A B e x t r a c t i o n ．A n dt h e a b o v em e t h o d sw e r ec o m p a r e dw i t ht

22、h a t o fb a c t e r i a l g e n o m i cD N A e x t r a c t i o nk i t ．T h em o d i f i e dm e t h o d s w e r ee f f e c t i v e i ng e n o m i c D N A e x t r a c t i o n ．t h ec o n c e n t r a t i o na n d p u r i t

23、 yo f t h eD N AW a s g o o d e n o u g hf o rP C R a m p l i f i c a t i o n ．K e y w o r d s ：1 3 - g a l a c t o s i d a s e ，A r t h r o b a c t e r s p ，l a c t u l o s e s ，m u t a g e n i z ew i t hU V ，D N Ae x 仃