節(jié)桿菌產(chǎn)β-半乳糖苷酶分離純化及動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析.pdf

1、β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)是一種無毒無副作用的生物酶制劑,既能水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖,解決在約占世界十分之一的人群中存在的乳糖不耐癥問題;還能催化轉(zhuǎn)移半乳糖苷反應(yīng),制備功能性低聚半乳糖和具有臨床治療功能的乳果糖。
　　 本實(shí)驗(yàn)室分離得到一株產(chǎn)β-半乳糖苷酶的節(jié)桿菌,該β-半乳糖苷酶同時(shí)具有水解與轉(zhuǎn)苷活性,本研究以分離純化該酶并研究其酶學(xué)性質(zhì)為目的。以乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)節(jié)桿菌,離心收集菌體,超聲破碎細(xì)胞得到粗酶液;

2、采用硫酸銨沉淀、Phenyl-Sepharose疏水、DEAE-Sepharose離子交換和p-aminobenzyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(PABTG)親和層析方法進(jìn)行酶的分離純化,純化倍數(shù)達(dá)到31.4,經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)分子量為30kD。
　　 以鄰硝基苯-α-D-P比喃葡萄糖苷(ONPG)為底物,研究純化后β-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì),結(jié)果表明:該酶最適pn值為6.6,最適反應(yīng)溫度為13

3、7℃,pH在6.0～8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好,相對(duì)酶活均在80％以上,溫度低于30℃時(shí),相對(duì)酶活在1 h內(nèi)保持在50％以上。Mg2+、Mn2+、Co2+、K+對(duì)酶有顯著的激活作用,Cu2+、Ag+則有明顯的抑制作用。添加金屬離子可以提高酶的熱穩(wěn)定性,尤其是1 mmol/L的Mn2+,使酶在45℃時(shí)保持60 min酶活幾乎沒有損失。以O(shè)NPG為底物時(shí)測(cè)得β-半乳糖苷酶的米氏常數(shù)為4.64mmol/L,最大反應(yīng)速率為0.919μmol/min

4、。
　　 以乳糖為底物,研究純化后β-半乳糖苷酶的水解能力,并通過高效液相色譜法(HPLC)分析產(chǎn)物中葡萄糖的含量,結(jié)果顯示水解乳糖的最適條件:乳糖濃度為3％,反應(yīng)溫度為30℃,反應(yīng)時(shí)間為6～8 h,pH在6.5～7.0時(shí)反應(yīng)速率達(dá)到最大。
　　 本文還研究了β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)半乳糖苷性質(zhì),以果糖為轉(zhuǎn)苷受體,采用高效液相色譜法測(cè)定酶反應(yīng)產(chǎn)物中乳果糖的含量,進(jìn)而分析該酶的轉(zhuǎn)苷活性,結(jié)果表明:轉(zhuǎn)苷的最適溫度為20℃,最適pH