α—半乳糖苷酶發(fā)酵工藝、分離純化及其應(yīng)用研究.pdf

1、α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，EC 3.2.1.22)屬外切糖苷酶類，能特異性水解半乳糖類寡糖和多聚半乳-(葡)甘露聚糖的非還原性末端α-1，6-半乳糖苷鍵，因此水解的底物主要為棉籽糖類寡糖，如：棉籽糖、水蘇糖、蜜二糖和毛蕊花糖等。該酶在食品、飼料和醫(yī)藥等領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用前景。本論文從α-半乳糖苷酶高產(chǎn)菌種選育開(kāi)始，研究了α-半乳糖苷酶發(fā)酵技術(shù)及工藝，對(duì)液體發(fā)酵產(chǎn)生的α-半乳糖苷酶進(jìn)行純化，并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)及酶促反應(yīng)動(dòng)

2、力學(xué)進(jìn)行了深入研究，驗(yàn)證了純化后的α-半乳糖苷酶對(duì)豆粕、棉籽粕和菜籽粕中α-半乳糖苷寡糖的水解作用，同時(shí)進(jìn)行了單胃動(dòng)物的飼養(yǎng)試驗(yàn)。論文的主要研究結(jié)果如下： (1)從發(fā)酵的醬醅中分離并篩選到一株高產(chǎn)α-半乳糖苷酶的曲霉菌株，發(fā)酵96 h后的酶活達(dá)到22.27 U/mL，經(jīng)鑒定為臭曲霉Aspergillus foetidus。出發(fā)菌株經(jīng)<'60>Co-γ輻射和N<'+>離子束輻照，突變株Aspergillus foetidus ZU

3、-G1分泌的α-半乳糖苷酶酶活比出發(fā)菌株分別提高了20.7％和23.4％，培養(yǎng)96h后的酶活分別達(dá)到26.88 U/mL和33.18 U/mL。 (2)為了確認(rèn)該菌株產(chǎn)的α-半乳糖苷酶能安全應(yīng)用在食品和飼料工業(yè)，進(jìn)行了小鼠急性經(jīng)口毒理試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明α-半乳糖苷酶粗酶液屬于實(shí)際無(wú)毒類。 (3)利用單因素試驗(yàn)篩選出該菌株液體發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的適宜培養(yǎng)基組分，麩皮是適宜的碳源，豆粕是適宜的氮源，KH<,2>PO<,4>

4、和FeSO<,4>·7H<,2>O利于α-半乳糖苷酶的分泌。用響應(yīng)面優(yōu)化方法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基組成為：3.28％豆粕(w/v)，2％麥麩(w/v)，0.1％KH<,2>PO<,4>(w/v)和0.05％FeSO<,4>·7H<,2>O(w/v)，初始pH 6.31。用此培養(yǎng)基發(fā)酵144h，α-半乳糖苷酶酶活達(dá)到104.7 U/ml。 該菌株液體發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的最佳產(chǎn)酶條件為：發(fā)酵溫度28℃，轉(zhuǎn)速200

5、r/min，250 ml的三角瓶中裝30 ml培養(yǎng)基，接種量6.6％，18 h的種子培養(yǎng)液接種。 (4)該菌株固體發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基水分含量60％，發(fā)酵溫度28℃，18 h的種子培養(yǎng)液接種，接種量10％，pH6.0，紗布層數(shù)為6層，250 ml的三角瓶中裝10g干基的培養(yǎng)基。 利用單因素試驗(yàn)獲得該菌株產(chǎn)α-半乳糖苷酶的適宜培養(yǎng)基組分，豆粕、麩皮、MnSO<,4>·H<,2>O和CuSO<,4>·

6、5H<,2>O有利于α-半乳糖苷酶的分泌。采用響應(yīng)面優(yōu)化方法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，獲得最佳培養(yǎng)基組成為(g/10g干基)：麩皮8.2137g，豆粕1.7843g，MnSO<,4>·H<,2>O0.001g和CuSO<,4>·5H<,2>O 0.001g，在此優(yōu)化培養(yǎng)基下發(fā)酵產(chǎn)α-半乳糖苷酶，培養(yǎng)144h后酶活達(dá)到2572.53 U/g。 (5)該菌株發(fā)酵液經(jīng)過(guò)分級(jí)鹽析、離子交換柱層析和分子篩柱層析，得到了電泳純?chǔ)?半乳糖苷酶，

7、其中α-galⅠ分子量為106.3 KDa，α-galⅡ分子量為49.7 KDa，α-galⅢ分子量為107.9 KDa。純化后α-半乳糖苷酶的三組分最適作用溫度均為60℃；α-半乳糖苷酶三組分的最適作用pH不同，α-galⅠ和α-galⅢ的最適反應(yīng)pH為5.0，α-galⅡ?yàn)?.0；就酸堿穩(wěn)定性而言，α-galⅠ在pH 4.0的環(huán)境中最穩(wěn)定(酶活保留率達(dá)78.9％)，α-galⅡ在pH 6.0的環(huán)境中最穩(wěn)定(酶活保留率達(dá)73.7％)，

8、α-galⅢ在pH 5.0的環(huán)境中最穩(wěn)定(酶活保留率達(dá)88.4％)。 (6)不同金屬離子和糖類等對(duì)α-半乳糖苷酶三組分酶活的影響是不同的：三組分均受Ag<'+>強(qiáng)烈抑制，Cu<'2+>對(duì)α-gal Ⅰ和α-gal Ⅲ有明顯的抑制作用，而對(duì)α-galⅡ有激活作用。Ca<'2+>、Mg<'2+>、K<'+>和Na<'+>對(duì)α-gal Ⅰ酶活的影響不大，Mn<'2+>離子有激活作用；Ca<'2+>、Mg<'2+>、Zn<'2+>和M

9、n<'2+>對(duì)α-galⅡ有激活作用，K<'+>和Na<'+>有抑制作用；Ca<'2+>、Zn<'2+>和K<'+>對(duì)α-galⅢ酶活的影響不大，Mg<'2+>、Mn<'2+>和Na<'+>離子有激活作用。SDS對(duì)α-半乳糖苷酶α-gal Ⅰ和α-gal Ⅲ有明顯的抑制作用，而對(duì)α-gal Ⅱ影響較小，EDTA、乳糖、棉籽糖對(duì)三組分均有抑制作用，海藻糖、甘露糖、CaCl·2H<,2>O和巰基乙醇對(duì)α-gal Ⅰ和α-galⅡ均有抑制作用

10、，而對(duì)α-galⅢ組分幾乎無(wú)影響。 (7)α-gal Ⅰ對(duì)對(duì)硝基-α-D-半乳糖苷的米氏常數(shù)Km=9.39mmol/L，對(duì)水蘇糖的Km=12.79mmol/L，對(duì)棉籽糖的Km=4.79mmol/L，對(duì)蜜二糖的Km=1.03 mmol/L；α-galⅡ?qū)?duì)硝基-α-D-半乳糖苷的米氏常數(shù)Km=6.54mmol/L，對(duì)水蘇糖的Km=2.39mmol/L，對(duì)棉籽糖的Km=11.38mmol/L，對(duì)蜜二糖的Km=2.02 mmol/L；

11、α-galⅢ對(duì)對(duì)硝基-α-D-半乳糖苷的米氏常數(shù)Km=8.24mmol/L，對(duì)水蘇糖的Km=9.98mmol/L，對(duì)棉籽糖的Km=4.33mmol/L，對(duì)蜜二糖的Km=3.18mmol/L。 (8)甘露醇、海藻糖和棉籽糖對(duì)α-半乳糖苷酶粗酶液熱穩(wěn)定性有較好的保護(hù)作用。采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)獲得了復(fù)合保護(hù)劑配方為：1.75mmol/L的海藻糖，1.5mmol/L的甘露醇和2mmol/L的棉籽糖。復(fù)合保護(hù)劑的添加能使α-半乳糖苷酶在30℃

12、～60℃范圍內(nèi)的酶活保留率提高11.6％～21.7％，28℃存放24h，該酶在pH3.0的環(huán)境中保留52％的活性。Α-半乳糖苷酶在28℃、36.2℃和45℃下貯存，酶活損失50％的時(shí)間分別為：液體酶對(duì)照組51.90、28.13和7.31天；液體酶處理組：97.11、40.68和7.49天，而固體α-半乳糖苷酶損失50％所需時(shí)間分別為：88.54、24.47和8.78天。 (9)純化后的α-半乳糖苷酶α-gal Ⅰ、α-gal Ⅱ

13、和α-gal Ⅲ均能水解豆粕乳、棉籽粕乳和菜籽粕乳中的水蘇糖、棉籽糖等寡糖。 Α-galⅠ、α-gal Ⅱ和α-galⅢ均能水解豆粕乳中水蘇糖和棉籽糖。Α-galⅡ?qū)λK糖的水解能力大于α-galⅠ和α-gal Ⅲ，50℃比40℃更易使豆粕乳中水蘇糖游離出。40℃和50℃水浴溫度下，反應(yīng)1～5h，α-galⅡ?qū)Χ蛊扇橹忻拮烟堑乃饴蔬_(dá)100％；α-gal Ⅰ和α-galⅢ對(duì)棉籽糖的水解能力較弱，50℃比40℃更有利于棉籽糖的生成

14、。 Α-galⅠ、α-gal Ⅱ和α-galⅢ對(duì)棉籽粕乳具有水解作用。Α-galⅡ?qū)λK糖的水解能力比α-gal Ⅰ、α-gal Ⅲ高。Α-gal Ⅱ?qū)γ拮烟堑乃饽芰ψ顝?qiáng)，40℃時(shí)反應(yīng)3h，水解率達(dá)99.9％。其次是α-gal Ⅲ，其對(duì)棉籽糖的水解率在40℃時(shí)以3h最高，為43.3％，50℃時(shí)4h最高，為84.71％。Α-gal Ⅰ對(duì)棉籽糖的水解能力較弱。Α-gal Ⅰ、α-galⅡ和α-galⅢ對(duì)菜籽粕乳有水解作用。其中，α

15、-gal Ⅲ對(duì)水蘇糖的水解能力最強(qiáng)；在40℃和50℃水浴溫度下，水蘇糖的水解率為100％。40℃時(shí)，α-galⅡ作用3h，而50℃作用2h，水蘇糖完全被酶解；α-gal Ⅰ對(duì)水蘇糖的水解能力較弱，與50℃相比，40℃更不利于水解。40℃時(shí)，α-gal Ⅰ作用1h，可將棉籽糖幾乎完全水解；而α-galⅡ和α-galⅢ對(duì)棉籽糖的水解能力弱。50℃時(shí)，三者對(duì)棉籽糖的水解能力均很弱。 (10)固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)的α-半乳糖苷酶粗酶制劑以0.