適合乳果糖制備的β-半乳糖苷酶高產(chǎn)株的篩選及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化.pdf

1、乳果糖(lactulose)，又稱(chēng)作乳酮糖、異構(gòu)乳糖，是由半乳糖和果糖以β-1，4糖苷鍵結(jié)合的二糖。乳果糖屬于非消化性低聚糖，具有低甜度、低熱能、低致齲齒性、選擇性的促進(jìn)人體腸道內(nèi)有益菌增殖等生理學(xué)性質(zhì)，在食品、保健品、藥品的應(yīng)用潛力很大。目前商業(yè)上生產(chǎn)乳果糖的方法是用化學(xué)合成法，但化學(xué)合成法存在很大缺點(diǎn)如：大量的有色副產(chǎn)物難以分離，分離這些副產(chǎn)物的成本較高并在分離的過(guò)程中使乳果糖降解，酶法合成乳果糖可以克服化學(xué)合成的缺點(diǎn)。本論文以篩選

2、適合生產(chǎn)乳果糖的β-半乳糖苷酶高產(chǎn)菌株為目標(biāo)，對(duì)產(chǎn)β-半乳糖苷酶的菌株誘變篩選、培養(yǎng)基及搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化、β-半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究、篩選所得菌株發(fā)酵罐發(fā)酵條件的確定和酶法合成乳果糖的過(guò)程進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 以乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)為出發(fā)菌株，物理誘變和化學(xué)誘變相結(jié)合的方法，5-溴-4-氯-3-吲哚-吡喃半乳糖苷(簡(jiǎn)稱(chēng)X-Gal)作為篩子，經(jīng)過(guò)紫外誘變、超聲誘變和甲基磺酸乙酯(EM

3、S)誘變，篩選出一株具有較高轉(zhuǎn)糖苷活力乳果糖高產(chǎn)菌株，菌株編號(hào)為乳酸克魯維酵母K.lactisI-16-7。該菌株產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶以O(shè)NPG為底物的酶活較誘變前提高了3.00倍，以乳糖為底物的酶活較誘變前提高了2.75倍，乳果糖產(chǎn)量可達(dá)44.88g/L。對(duì)該菌株培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為酵母膏10.7g/L，蛋白胨F403為9.4g/L，乳糖12.1g/L，MgSO45.6g/L，KH2PO44.7g/L。最佳

4、培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度30℃，pH6.0，裝液量40mL/250mL，搖床轉(zhuǎn)速160rpm，接種量6％，培養(yǎng)時(shí)間24h。在最佳條件下酶活最大可達(dá)10.64U/mL。 乳酸克魯維酵母K.lactisl-16-7β-半乳糖苷酶最適反應(yīng)溫度為40℃；最適pH為7.0；Na+、cu2+對(duì)β-半乳糖苷酶有抑制作用，Co2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+對(duì)β-半乳糖苷酶具有激活作用，其中Mgz+的激活作用最大。 在搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)上進(jìn)行了2

5、L發(fā)酵罐擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵罐擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。此時(shí)β-半乳糖苷酶酶活約為33.47U/mL，比搖瓶發(fā)酵提高了213.8％。 以乳糖和果糖為底物，由乳酸克魯維酵母K.lactisl-16-7β-半乳糖苷酶催化生成乳果糖的最佳反應(yīng)條件為：乳糖和果糖的最佳比例為質(zhì)量比為2:1摩爾比為1:1，乳糖和果糖的最佳濃度分別為40％(w/v)和20％(w/v)，加酶量為3U/mL，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)體系pH為7.0，反應(yīng)時(shí)