新生大鼠心房肌細(xì)胞kir3.1基因sirna的篩選與鑒定的實(shí)驗(yàn)研究

1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人申明所呈交的學(xué)位論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得我?；蚱渌逃龣C(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料，與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處，本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者簽名：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文版權(quán)

2、使用授權(quán)書本人完全了解中國(guó)醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的規(guī)定，即：研究生在攻讀學(xué)位期I “ ．- 1 論文工作的知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位屬中國(guó)醫(yī)科大學(xué)。本人保證畢業(yè)離校后，發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名單位為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，且導(dǎo)師為通訊作者，通訊作者單位亦署名為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容( 保密內(nèi)容除外) ，以采用影印、縮印或其他手段保存論文。論文儲(chǔ)

3、張塑蛩指導(dǎo)教師簽名： 。孟2 煎．日 期：墜! ! ! j·中文論著摘要·新生大鼠心房肌細(xì)胞K i r 3 ．1 基因s i R N A 的篩選與鑒定的實(shí)驗(yàn)研究目 的心動(dòng)過緩是臨床上最常見的心律失常之一，人群發(fā)病率高，是威脅人類健康和長(zhǎng)壽的常見心血管病之一。其發(fā)生機(jī)制與迷走神經(jīng)系統(tǒng)活性密切相關(guān)。心臟迷走神經(jīng)通過釋放乙酰膽堿( A c e t y l c h o l i n e ，A C h ) 作用于心房毒蕈樣2 受

4、體．G 蛋白．乙酰膽堿敏感性鉀電流通道，激活乙酰膽堿敏感性鉀通道( A c e t y l c h o l i n e ．s e n s i t i v em u s c a r i n i cK + c h a n n e l ，K A C h ) 使鉀離子外流增加。進(jìn)而使動(dòng)作電位4 位相最大復(fù)極電壓絕對(duì)值增大，使心肌細(xì)胞自律性降低，導(dǎo)致心動(dòng)過緩的發(fā)生。K A C h 道由K i r 3 ．1 ／K i r 3 ．4 基因共同編碼的蛋

5、白亞基組成。研究表明：該通道的功能主要與Ⅺr 3 ．1 基因有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用特異性小R N A 干擾( S m a l li n t e r f e r e n c e R N A ，s i R N A ) 抑制新生S D 大鼠心房肌細(xì)胞鼬r 3 ．1 基因表達(dá)；以篩選出干擾效率最高的s i R N A ，并應(yīng)用分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定，為今后將R N A 干擾技術(shù)引入心動(dòng)過緩機(jī)制的研究及基因治療心動(dòng)過緩提供新思路。方法體外人工合成3 對(duì)

6、針對(duì)飚r 3 ．1 基因的s i R N A 寡核苷酸片段，分別轉(zhuǎn)染至心房肌細(xì)胞。應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)( R e a l ．t i m e P o l y l n e r a sC h a i n r e a c t i o n ，R e a l ．t i m eP C R ) 方法篩選出抑制率最高的s i R N A ，并將其轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)的新生S D 大鼠心房肌細(xì)胞，收集空白組細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染后2 4 h ，4 8 h ，7 2 h

7、 ，9 6 h 的細(xì)胞，分別利用R e a l —t i m eP C R 、蛋白免疫印記( W e s t e r n b l o t ) 檢測(cè)Ⅺr 3 ．1m R N A 和蛋白質(zhì)的表達(dá)。勿七 甲 耋日7 尺( 1 ) 酶消化法培養(yǎng)的大鼠心房肌細(xì)胞純度和活力均高，7 2 h 后體外培養(yǎng)的新生鼠心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)密度可達(dá)瓶底7 0 ％，并出現(xiàn)細(xì)胞簇的同步搏動(dòng)，免疫熒光法檢測(cè)心肌細(xì)胞純度達(dá)9 0 ％以上；( 2 ) 人工合成的s i R N