siRNA干擾B因子基因的表達(dá)及其抑制大鼠脈絡(luò)膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：在眼部疾病中，血管增生過度是一大類致盲性眼病的根本原因，其中脈絡(luò)膜新生血管性疾病占據(jù)較大比例。脈絡(luò)膜新生血管(Choroidal Neovascularization，CNV)的生長及其所導(dǎo)致的出血、滲出、增生等是多種致盲眼病的主要病理過程。血管新生是多種分子共同作用的結(jié)果，而以往的研究多是針對(duì)單分子來控制血管新生，這些方法雖然顯示出一定抑制作用，但畢竟單分子作用是微弱的，并且都不能從根本上解決CNV的發(fā)生及其復(fù)發(fā)問題，故抗血管新

2、生的作用也是有限的。最新研究表明補(bǔ)體活化的旁路途徑可能是激光誘導(dǎo)大鼠CNV生成的相關(guān)因素的根本原因。為了進(jìn)一步探討旁路途徑在激光誘導(dǎo)的CNV生成中的作用，本研究利用了旁路途徑中一個(gè)重要因子B因子(complement factor B，CFB)作為阻斷旁路途徑的靶點(diǎn)，觀測補(bǔ)體活化的旁路途徑對(duì)CNV生成及其相關(guān)生長因子表達(dá)的抑制作用。 方法：1 CFB-siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 1.1 以人CFB mRNA為模板，設(shè)計(jì)與大

3、鼠同源的、針對(duì)CFB基因編碼區(qū)的CFB-siRNA序列，并在體外轉(zhuǎn)錄合成。 1.2 雙酶切質(zhì)粒pRNAT-U6.1/Neo，與CFB-siRNA鏈連接，構(gòu)建CFB-siRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞(E.coli)后采用PCR、雙酶切(BamHI和HindIII)、膠回收、連接后得到重組質(zhì)粒pRNAT-U6.1/CFB-siRNA，并進(jìn)行測序鑒定和PCR鑒定。 1.3 用電轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組質(zhì)粒pRNAT-U6.1/CFB

4、-siRNA轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304(電轉(zhuǎn)參數(shù)：電容：900μF，電壓0.2kv，電阻：+8，時(shí)間：70ms，脈沖次數(shù)：1次)，命名為CFB-siRNA組；將等量空質(zhì)粒以同樣條件轉(zhuǎn)染ECV-304，命名為空質(zhì)粒組；未轉(zhuǎn)染細(xì)胞命名為正常對(duì)照組。 1.4 轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48h后于倒置熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。收集各組ECV-304進(jìn)行RT-PCR，測定CFB mRNA的表達(dá)，并用Bandleader凝膠圖像分析軟件對(duì)

5、凝膠電泳條帶進(jìn)行灰度值分析；四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)檢測各組細(xì)胞的生長抑制率；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：凝膠電泳條帶灰度值用-X±s表達(dá)，兩個(gè)樣本均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用X2檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均用SAS軟件包統(tǒng)計(jì)。P＜0.05為差異有顯著性意義。 2重組CFB-siRNA抑制激光誘導(dǎo)的大鼠脈絡(luò)膜新生血管生成的體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 2.1 CNV模型的建立：健康成年棕色挪威(BrownNorway，BN

6、)大鼠42只，激光光凝方式建立CNV動(dòng)物模型，隨機(jī)分為尾靜脈注射組，玻璃體腔注射組，視網(wǎng)膜下腔注射組，對(duì)照組。三種不同的注射方式組分別設(shè)有相應(yīng)的空質(zhì)粒注射組。共7組，6只/組。 2.2 光凝后第1、3、5天分別給予各組的大鼠進(jìn)行注射，對(duì)照組光凝后不給予任何干預(yù)。 2.3 玻璃體注射組和視網(wǎng)膜下腔注射組在注射后第1、2、3天觀察其晶體、玻璃體及視網(wǎng)膜情況。 2.4 光凝后第7天、第14天行熒光素眼底血管造影(fun

7、dus fluorescein angiography，F(xiàn)FA)，根據(jù)熒光滲漏程度對(duì)各光凝斑評(píng)分來檢測新生血管的生成情況。 2.5 免疫組織化學(xué)法從蛋白水平檢測各組大鼠脈絡(luò)膜內(nèi)血管生成相關(guān)因子：血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)、第Ⅷ因子(factorⅧ)的表達(dá)情況。Imagepro plus圖像分析軟件進(jìn)行吸光度值檢測。 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：計(jì)數(shù)資料用x2檢

8、驗(yàn)。免疫組化結(jié)果的吸光度值(A)用X±s表達(dá)。所有數(shù)據(jù)均用SAS軟件包統(tǒng)計(jì)。P＜0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)果：1 CFB-siRNA表達(dá)載體構(gòu)建 1.1 將CFB-siRNA定向插入到pRNAT-U6.1的BamH Ⅰ和HindⅢ內(nèi)切酶位點(diǎn)，測序結(jié)果顯示同設(shè)計(jì)序列完全相同，表明人CFB-siRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。 1.2 倒置熒光顯微鏡下，轉(zhuǎn)染CFB-siRNA、空質(zhì)粒的ECV-304細(xì)胞均可看見清晰

9、的綠色熒光，說明轉(zhuǎn)染成功。 1.3 收集ECV-304細(xì)胞，提取RNA，RT-PCR檢測重組質(zhì)粒對(duì)CFB mRNA的抑制率，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組和空質(zhì)粒組相比，CFB-siRNA組對(duì)CFB有明顯的抑制效果(P＜0.05)。 1.4 MTT法檢測CFB-siRNA組的細(xì)胞在24h的抑制率為23.45％，48h的抑制率為33.48％，72h的抑制率為45.49％，而空質(zhì)粒組對(duì)ECV-304細(xì)胞生長沒有影響。 1.5

10、 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，CFB-siRNA對(duì)ECV-304的抑制作用主要是將ECV-304的生長阻滯在細(xì)胞周期的間期G1期。 2重組CFB-siRNA抑制激光誘導(dǎo)的大鼠脈絡(luò)膜新生血管生成的體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 2.1 健康成年BN大鼠42只，激光光凝方式建立CNV模型，隨機(jī)分為7組，每組6只：(1)CFB-siRNA尾靜脈注射組；(2)空質(zhì)粒尾靜脈注射組；(3)CFB-siRNA玻璃體腔注射組；(4)空質(zhì)粒玻璃體腔注射組；(5)CFB

11、-siRNA視網(wǎng)膜下腔注射組；(6)空質(zhì)粒視網(wǎng)膜下腔注射組；(7)對(duì)照組(光凝后不予處理)。 2.2 玻璃體注射組和視網(wǎng)膜下腔注射組在注射后第1、2、3天觀察晶體、玻璃體均透明，無明顯炎性反應(yīng)，視網(wǎng)膜在位。 2.3 各光凝斑熒光滲漏程度評(píng)分結(jié)果顯示：CFB-siRNA尾靜脈注射組與其它各組相比熒光滲漏程度輕，且差別有顯著意義(P＜0.05)。 2.4 免疫組化結(jié)果：CFB-siRNA尾靜脈注射組VEGF、fact

12、orⅧ的陽性表達(dá)強(qiáng)度不同時(shí)間點(diǎn)之間無顯著差異(P＞0.05)，而與同時(shí)間點(diǎn)其它各組相比明顯降低，且差異有顯著意義(P＜0.05)。其它各組不同時(shí)間點(diǎn)VEGF、factorⅧ的陽性表達(dá)強(qiáng)度，光凝后14d顯著強(qiáng)于光凝后7d，差異有顯著性(P＜0.05)。 結(jié)論：1體外重組CFB-siRNA可高效地沉默CFB基因的表達(dá)，為第二部分的體內(nèi)試驗(yàn)提供了工具。 2經(jīng)電轉(zhuǎn)染方法成功的將重組CFB-siRNA轉(zhuǎn)染ECV-304，并在一定程

13、度上抑制ECV-304細(xì)胞的增殖。 3激光光凝的方法成功誘導(dǎo)BN大鼠CNV模型，方法簡單易行，成模時(shí)間短，成模率高，可用來模仿人類CNV病變進(jìn)行防治研究。 4重組CFB-siRNA能有效的抑制體內(nèi)CNV的生成，并且從蛋白水平證明能下調(diào)VEGF及factorⅧ的表達(dá)水平。 5尾靜脈快速注射重組CFB-siRNA對(duì)于CNV的抑制效果最佳。 6本研究為脈絡(luò)膜新生血管性疾病的基因治療方案，提供了新的可靠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和