新es胚胎干細(xì)胞

1、內(nèi) 容,個(gè)體發(fā)生過程干細(xì)胞的概念胚胎干細(xì)胞概念應(yīng)用前景面臨的問題及解決辦法,一 、個(gè)體發(fā)生過程 受精 卵裂 受精后72h 受精后5-7天精子+卵子 合子 卵裂球 桑椹胚 囊胚

2、 滋養(yǎng)層?胎盤及胎兒附屬結(jié)構(gòu)囊胚 內(nèi)胚層?消化道、呼吸道上皮和腺體；肝；膽；胰。 內(nèi)細(xì)胞群 中胚層?結(jié)締組織；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系統(tǒng) 外胚層?體表結(jié)構(gòu)；神經(jīng)系統(tǒng),,,,,,,,,,,囊 胚,,,,,ICM,二、干細(xì)胞的概念,1、干細(xì)胞：具有自我復(fù)制的能力，在一定條件下

3、能分化成各種功能細(xì)胞。,2、分類,（1）全能干細(xì)胞，包括：胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells, ES細(xì)胞）生殖干細(xì)胞（embryonic germ cells, EG細(xì)胞） 具有全能性，能夠分化成所有細(xì)胞類型， 進(jìn)一步形成機(jī)體的任何組織和器官。（2）多能干細(xì)胞：具有分化成多種細(xì)胞和組織的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力。（3）專能干細(xì)胞：只能向一種或密切相關(guān)的兩種類型的細(xì)胞分化。,,干細(xì)胞是一種能夠分裂

4、成與自身一致的細(xì)胞或幾種特殊分化的細(xì)胞型的細(xì)胞。動(dòng)物體內(nèi)干細(xì)胞的正常作用是在發(fā)育的過程中可提供不同的細(xì)胞型,以生長成不同的組織和器官。它們也提供替代細(xì)胞以修復(fù)身體不同部分的損傷。,,干細(xì)胞療法就是利用已特殊分化的干細(xì)胞,通過特殊的途徑提供細(xì)胞去替代那些在退行性過程和損傷中失去的細(xì)胞。使用未分化干細(xì)胞也存在畸胎瘤和其他腫瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)。,,目前人干細(xì)胞的主要來源或者潛在來源如下: ①胚泡,可以提供多能干細(xì)胞; ②胎兒組

5、織,可以提供多能或者專能干細(xì)胞; ③臍帶血,可以提供專能干細(xì)胞; ④成人組織,可提供專能干細(xì)胞或單能干細(xì)胞。,三、胚胎干細(xì)胞,1、概念胚胎干細(xì)胞 (embryonic stem cells,ESC)是一種從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞經(jīng)分離、體外培養(yǎng)、克隆等得到的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞。ES細(xì)胞可不斷保持增殖而不分化且在連續(xù)培養(yǎng)后仍能具有發(fā)育成三個(gè)胚層的潛能。 這種細(xì)胞具有與早期胚胎相似的分化潛能和正常二倍體核型

6、，因此兼有早期胚胎卵裂球及體細(xì)胞的某些特性。,,ES細(xì)胞的全能性（totipotenty），是指ES細(xì)胞在解除分化抑制的條件下能參與包括生殖腺在內(nèi)的各種組織的發(fā)育潛力，即ES細(xì)胞發(fā)育成完整動(dòng)物體的能力。其實(shí)質(zhì)是細(xì)胞基因組中決定蛋白質(zhì)編碼的所有基因按一定的時(shí)空順序依次表達(dá)。ES細(xì)胞是能在體外大量增殖的全能性細(xì)胞，可以為細(xì)胞的遺傳操作和細(xì)胞分化研究提供豐富的實(shí)驗(yàn)材料。,,ES細(xì)胞全能性的檢測(cè)方法是以胚胎干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核移植。如果ES細(xì)胞能

7、和去核的細(xì)胞融合發(fā)育成重構(gòu)胚，而且經(jīng)過胚胎移植，重構(gòu)胚能發(fā)育形成個(gè)體，則表明ES細(xì)胞具有全能性。例如，將綿羊的類ES細(xì)胞注射到去核卵母細(xì)胞中，獲得重構(gòu)胚。重構(gòu)胚經(jīng)過胚胎移植，有活的羔羊產(chǎn)生，證明了綿羊的類ES細(xì)胞具有發(fā)育全能性。,2、ES細(xì)胞研究發(fā)展史,1981年，英國劍橋大學(xué)的Evans和Kaufman用囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)建立小鼠ES細(xì)胞系1998年美國Thomson從人的體外受精囊胚中分離得到了ES細(xì)胞。同年約翰霍普金斯大學(xué)

8、的Shamblott等從人的PGC細(xì)胞中分離得到人的全能性干細(xì)胞。人ES細(xì)胞的分離成功給人類的基因治療和器官移植打下了基礎(chǔ)。其他動(dòng)物只獲得了類ES細(xì)胞。,1999年12月，美國《科學(xué)》雜志公布了當(dāng)年世界科學(xué)進(jìn)展的評(píng)定結(jié)果，干細(xì)胞的研究成果列在舉世矚目耗資巨大的人類基因組工程之前，名列十大科學(xué)進(jìn)展首位。2002年3月，美國麻省理工學(xué)院的科學(xué)家宣布，他們首次利用人體胚胎干細(xì)胞培育出毛細(xì)血管，證明了胚胎干細(xì)胞技術(shù)在治療心血管疾病等領(lǐng)域的

9、應(yīng)用潛力。目前已有報(bào)導(dǎo)ES細(xì)胞能在適當(dāng)條件下分化為心肌細(xì)胞，胰島細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，肝細(xì)胞等。,衍生自囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始外胚層的細(xì)胞；永生化(immortal)；能維持穩(wěn)定的正常的二倍體染色體結(jié)構(gòu)；有穩(wěn)定的發(fā)育潛能，能被誘導(dǎo)增殖或分化；能參與胎兒所有組織的發(fā)育過程；,3、胚胎干細(xì)胞的性質(zhì),4、胚胎干細(xì)胞系的建立過程,4.1 概述,4.2 胚胎干細(xì)胞的分離酶消化后培養(yǎng)免疫方法去處滋養(yǎng)層細(xì)胞流式細(xì)胞儀分離法,4.3 培

10、養(yǎng)條件：(1) 特殊的培養(yǎng)液：用DMEM培養(yǎng)液，其中胎牛血清的濃度和質(zhì)量很重要，加非必須氨基酸；β-巰基乙醇。(2) 以人或胚鼠的成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層細(xì)胞。(3) 必須加入LIF，抑制細(xì)胞分化。,早期胚胎及PGCs的培養(yǎng),將早期胚胎或PGCs置于飼養(yǎng)層或條件培養(yǎng)基上，在5%CO2、37－39度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)液一般為DMEEM+15%FCS。培養(yǎng)液中可添加多種細(xì)胞因子或分化抑制物，如LIF.EGF.IGF. 3-巰基乙醇等。,

11、傳 代,進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)ICM增殖后或PGCs出現(xiàn)ES樣克隆后即可傳代。ESC的增殖速度很快，小鼠ESC每7－8h倍增一次;豬類ESC每20h倍增一次;羊類ESC，每40－50h倍增一次;牛類ESC每18－24h倍增一次。傳代時(shí)一般是用胰酶EDTA消化，再用微吸管或撥針將其打散成單個(gè)細(xì)胞，然后移入新的飼養(yǎng)層上，培養(yǎng)幾天后，即可出現(xiàn)新的克隆點(diǎn)，在其分化之前可以再進(jìn)行傳代。,5. 胚胎干細(xì)胞的鑒別 （1）細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu) ES細(xì)

12、胞形態(tài)表現(xiàn)為胞體小、泡狀、核大 (核質(zhì)比高)、細(xì)胞聚集成集落生長（鳥巢狀）、細(xì)胞排列緊密、無細(xì)胞界限、能連續(xù)穩(wěn)定傳代且不分化。（2）細(xì)胞功能（3）細(xì)胞表面的特殊標(biāo)志：AKP陽性（4）細(xì)胞內(nèi)特異基因的表達(dá),胚胎干細(xì)胞檢測(cè)指標(biāo),(1) 細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性高(2) 端粒酶活性高(3) 不被Hoechst33342 和Rhodamine123染色(4) 細(xì)胞膜表面有特殊的標(biāo)記：SSEA-3, SSEA-4, 　 TRA-1

13、-60, TRA-1-81。(5) 能分化成三個(gè)胚層的細(xì)胞，將胚胎干細(xì)胞植　 入免疫缺陷小鼠皮下可產(chǎn)生畸胎瘤(6) 可誘導(dǎo)分化為各種成體干細(xì)胞,6. 兩種來源的ES細(xì)胞的區(qū)別,7. ES細(xì)胞的誘導(dǎo)分化,干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的常用方法（1）加入誘導(dǎo)細(xì)胞分化的因子或化學(xué)物質(zhì)， 如VGEF、bFGF 、DMSO和RA等（2）將ES細(xì)胞與特定的細(xì)胞共培養(yǎng) （3）將某種分化誘導(dǎo)因子的基因轉(zhuǎn)入ES細(xì)

14、 胞內(nèi),四、 ES細(xì)胞的應(yīng)用前景,胚胎干細(xì)胞（ES）成為當(dāng)今生命科學(xué)和生物技術(shù)研究的熱點(diǎn)。這與它具有“發(fā)育全能性”的神奇功能密切相關(guān)。干細(xì)胞是未分化的原始細(xì)胞。其中，全能干細(xì)胞能分化成人體200多種細(xì)胞類型，形成機(jī)體的任何細(xì)胞、組織和器官。,,倘能掌握其分化發(fā)育的規(guī)律，在人工條件下定向分化為所需的細(xì)胞、組織乃至器官，就可以用來治療目前還難以或無法治愈的帕金森氏病、早老性癡呆、白血病、糖尿病等頑癥，并且解決十分緊缺的組織和器官移植

15、的來源問題嗎？進(jìn)一步，與克隆技術(shù)相結(jié)合，運(yùn)用體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)來得到ES，還能解決細(xì)胞治療以及組織和器官移植的免疫排異難題。,1. 胚胎干細(xì)胞研究的意義,,,ES細(xì)胞特有的生物學(xué)特性,決定了其在生物學(xué)領(lǐng)域有著不可估量的應(yīng)用價(jià)值。 在進(jìn)行ES細(xì)胞建系和定向分化的同時(shí),以ES細(xì)胞為材料，在核移植、嵌合體、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究等方面也進(jìn)行了廣泛的嘗試,已經(jīng)充分體現(xiàn)出ES細(xì)胞在加快良種家畜繁育、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、哺乳動(dòng)物發(fā)育模型、基因和細(xì)胞治療等方

16、面有著廣闊的應(yīng)用前景。,,近幾年來，胚胎工程技術(shù)、基因工程技術(shù)、組織工程技術(shù)與ES細(xì)胞研究的結(jié)合已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)，將使相關(guān)的基礎(chǔ)學(xué)科研究以及醫(yī)藥業(yè)、畜牧業(yè)等發(fā)生重大變化，走向一個(gè)新的時(shí)代。,2. 胚胎干細(xì)胞的用途,為在細(xì)胞和分子水平研究研究哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育規(guī)律提供了良好的材料和方法，是基因功能研究的有效手段。細(xì)胞分化機(jī)制，細(xì)胞癌變機(jī)理用于新藥的發(fā)現(xiàn)、篩選及安全性實(shí)驗(yàn)：如藥物機(jī)理及毒性實(shí)驗(yàn)重要的臨床價(jià)值，可作為組織移植、細(xì)胞治療和基因

17、治療的細(xì)胞來源：制造細(xì)胞、組織和器官；人ES定向誘導(dǎo)分化為人體器官；生產(chǎn)用于人類器官移植的動(dòng)物器官：無免疫排斥；豬可以作為人異種器官移植的器官供體來源。,,生產(chǎn)克隆動(dòng)物：由于ES細(xì)胞是具有全能性、未分化的細(xì)胞，因此是制作克隆動(dòng)物很好的核供體。 生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：建立轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，抗病育種；藥用蛋白,,ES細(xì)胞可作為基因打靶的靶細(xì)胞，經(jīng)打靶引入定點(diǎn)整合外源基因，提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的整合率和表達(dá)效果。 ES細(xì)胞也可進(jìn)行基因敲除，獲得基因敲

18、除動(dòng)物，如豬可以作為人異種器官移植的器官供體來源。,,在發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)研究中，利用ES細(xì)胞研究細(xì)胞分化的機(jī)埋，有助于闡明細(xì)胞分化調(diào)節(jié)的機(jī)制。 ES細(xì)胞的多能性可以在一定培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)化為特定的細(xì)胞。試驗(yàn)證明，體外誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞的分化，可形成內(nèi)臟卵黃囊、心肌層，也可以得到神經(jīng)元樣細(xì)胞和成纖維樣的細(xì)胞。,,使人的ES細(xì)胞與豬等動(dòng)物的胚胎結(jié)合，可得到人-豬嵌合體動(dòng)物，由于ES細(xì)胞具有全能性，可分化形成不同胚層，包括某些器官，這樣的器官與

19、人的器官具有相同的免疫特性，因此它不會(huì)對(duì)人產(chǎn)生排異反應(yīng)。,,人的ES細(xì)胞也可在體外定向誘導(dǎo)培養(yǎng)，生產(chǎn)人的肌肉、神經(jīng)和造血細(xì)胞的細(xì)胞組織，在治療人的某些疾病上有重要的應(yīng)用價(jià)值?？茖W(xué)家們一直試圖誘導(dǎo)各種干細(xì)胞定向分化為特定的組織來替代那些受損的體內(nèi)組織，比如把產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞植入糖尿病患者體內(nèi)。,,科學(xué)家們已經(jīng)能夠使豬ES細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樘鴦?dòng)的心肌細(xì)胞，使人ES細(xì)胞生成神經(jīng)細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞，并能使小鼠ES細(xì)胞分化為內(nèi)胚層細(xì)胞。這些結(jié)果為細(xì)胞和組

20、織替代療法開辟了道路。目前，科學(xué)家已成功分離到人ES細(xì)胞，而體細(xì)胞克隆技術(shù)為生產(chǎn)患者自身的ES細(xì)胞提供了可能。,治療性克隆：體細(xì)胞核移植（SCNT）　　去核卵細(xì)胞 + 體細(xì)胞核 ?克隆 ?囊胚 ?分離內(nèi)細(xì)胞群 ?ES細(xì)胞,,把患者體細(xì)胞移植到去核卵母細(xì)胞中形成重組胚，把重組胚體外培養(yǎng)到囊胚，然后從囊胚內(nèi)分離出ES細(xì)胞，獲得的ES細(xì)胞使之定向分化為所需的特定細(xì)胞類型 (如神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和血細(xì)胞)，用于替代療法。這種核移植法的最終

21、目的是用于干細(xì)胞治療，而非得到克隆個(gè)體，科學(xué)家們稱之為“治療克隆”。生殖性克隆,2.,ES細(xì)胞研究的倫理問題,ES研究也引發(fā)了當(dāng)前最為激烈而敏感的倫理之爭。主要圍繞兩個(gè)問題而展開：一是如何看待胚胎。ES主要有三個(gè)來源：（1）（自然和人工）流產(chǎn)的胚胎；（2）輔助生殖剩余的胚胎；（3）通過體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移術(shù)得到的胚胎。,,不管哪一個(gè)來源，提取ES必定會(huì)損毀胚胎。于是，胚胎是不是生命，是不是人，研究ES是不是“毀滅生命”、“殺人”，

22、很自然地成為爭論的焦點(diǎn)。國內(nèi)認(rèn)為：與“胚胎”的生命相比，“人”的生命具有優(yōu)先權(quán)，可以殺死胚胎來救“人”的生命。,,另一焦點(diǎn)在于，是否必然滑向生殖性克隆。2003年10月，聯(lián)合國大會(huì)以80票贊成、79票反對(duì)、15票棄權(quán)的表決結(jié)果，將《禁止人的克隆生殖國際公約》推遲一年。世界各國都表示反對(duì)生殖性克隆，為什么這一國際公約通不過呢？因?yàn)?9個(gè)國家認(rèn)為治療性克隆必然滑向生殖性克隆，主張二者同時(shí)禁止。治療性克隆是ES研究的主要目的。封殺治療

23、性克隆，實(shí)際上就是要封殺ES研究。,ES細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展方向,ES細(xì)胞維持自我更新和定向分化的分子機(jī)理ES細(xì)胞治療技術(shù)的研究ES細(xì)胞作工具探討基因功能和個(gè)體的發(fā)生發(fā)育ES細(xì)胞治療中的免疫排斥問題治療型克隆技術(shù)分離ES細(xì)胞新途徑的研究用ES細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜,,ES細(xì)胞具有可以無限地傳代增殖，而且不改變其基因型和表現(xiàn)型的特點(diǎn)。 如果以ES細(xì)胞作為核供體進(jìn)行核移植,可以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量基因型和表現(xiàn)型完全相同的個(gè)體。

24、 而且用ES細(xì)胞與胚胎進(jìn)行嵌合克隆動(dòng)物,可以解決哺乳動(dòng)物遠(yuǎn)緣雜交的困難,生產(chǎn)出珍貴的動(dòng)物,也可以進(jìn)行異種動(dòng)物克隆,有助于保護(hù)珍惜野生動(dòng)物。,ES細(xì)胞與動(dòng)物克隆,,盡管體細(xì)胞克隆與ES細(xì)胞克隆相比有著易于取材的特點(diǎn)，但是體細(xì)胞克隆也存在著不少缺點(diǎn)，如生理和免疫缺陷，目前體細(xì)胞克隆還不能完全代替ES細(xì)胞克隆。,ES細(xì)胞作基因載體 目前常用的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法是向受精卵中注射DNA，外源基因的整合、表達(dá)和篩選工作是在個(gè)體水平上

25、進(jìn)行的，不僅工作繁瑣，周期長成功率低，產(chǎn)生的后代的遺傳性狀也常出現(xiàn)分離；,,而利用ES細(xì)胞作為基因載體，得到基因整合的細(xì)胞，將載體ES細(xì)胞直接進(jìn)行核移植或者通過與胚胎嵌合獲得嵌合動(dòng)物，ES細(xì)胞在嵌合體中分化發(fā)育成全能性的生殖細(xì)胞，即可以得到攜有目的基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。,,因?yàn)橐粋€(gè)優(yōu)良的ES細(xì)胞系不僅可以用于各種目的基因轉(zhuǎn)化，用各種方法將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞，而且外源基因的整合數(shù)目、位點(diǎn)、表達(dá)程序以及穩(wěn)定性等都可以在細(xì)胞水平上進(jìn)行加工，篩選，

26、在很大程度上加快了動(dòng)物遺傳工程的進(jìn)程。,,改善ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件，建立更有效更簡便的獲得ES細(xì)胞的方法。定向誘導(dǎo)分化成特定類型細(xì)胞，用于臨床疾病的治療，并解決免疫排斥和潛在的致腫瘤的問題。成體干細(xì)胞的橫向分化的能力以及與胚胎干細(xì)胞的比較，成體干細(xì)胞能否替代胚胎干細(xì)胞？,,嵌合體實(shí)驗(yàn)和克隆動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是將ES細(xì)胞與正常的胚胎融合制作嵌合體或?qū)S細(xì)胞作為核供體進(jìn)行核移植，產(chǎn)生克隆動(dòng)物后代。這兩者是檢驗(yàn)ES細(xì)胞的最有效、最有說服力的方法

27、。,,人的ES細(xì)胞可以高水平地表達(dá)端粒酶活性，二倍體的人體細(xì)胞不表達(dá)端粒酶，并且隨著年齡的增長端粒變短，而在組織培養(yǎng)達(dá)到一定增殖壽命時(shí)，就開始衰老。與此相反，端粒酶在生殖系和胚胎組織中都有很高的活性。ES細(xì)胞中的高水平端粒酶活性證實(shí)了它的壽命將超過體細(xì)胞。,,ES細(xì)胞系的分離效率低ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的理論和技術(shù)水平低：隨機(jī)的，運(yùn)氣。,,解決胚胎來源有限的途徑： 未成熟卵的體外成熟,避免免疫排斥的方法（1）Kn

28、ock-out 胚胎干細(xì)胞的組織相 容性抗原（2）Knock-in 受者的組織相容性抗原（3）與同一來源的造血干細(xì)胞一同移植（4）受者的體細(xì)胞核移植,,,胚胎嵌合技術(shù)研究概況,嵌合體 (chimera)一詞源于古希臘神話，其意是指獅頭、羊身、龍尾等部分拼湊起來的怪獸。中國的“龍”：九似 圖騰在生物學(xué)上是指同一個(gè)體中，基因型相異的細(xì)胞或組織混合存在的狀態(tài)。,天然嵌合體？,,騾子：不是。是雜種,1.定義,嵌合體

29、動(dòng)物是指由兩種或兩種以上具有不同遺傳性的細(xì)胞系組成的聚合胚發(fā)育成的個(gè)體。在卵裂期甚至受精卵期所形成的嵌合體為原發(fā)性嵌合體(成體中每個(gè)器官都有兩種類型的細(xì)胞）。胚胎發(fā)育的晚期，通過組織移植或嫁接等方法所形成的部分組織或器官的嵌合稱為次生性嵌合。,2.囊胚顯微注射法生產(chǎn)嵌合體,用顯微操作技術(shù)將供胚的全部內(nèi)細(xì)胞團(tuán)注入除去部分內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的受胚囊胚腔中，或?qū)⒐┡叩牟糠謨?nèi)細(xì)胞團(tuán)注入受胚的囊胚腔中，也可以向受胚囊胚腔中（或卵周間隙）注入16細(xì)胞至桑