血栓與止血的篩選試驗(yàn)及其臨床應(yīng)用

1、血栓與止血的篩選試驗(yàn)及其臨床應(yīng)用,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院王鴻利 王學(xué)鋒,迄今，檢測(cè)血栓與止血的試驗(yàn)逾百種，大致可分為篩選試驗(yàn)、確診試驗(yàn)、排除試驗(yàn)和基因分析等四大類。本文僅就篩選實(shí)驗(yàn)，如出血時(shí)間（BT）、血小板計(jì)數(shù)（PLT），活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶原時(shí)間（PT），纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物（FDPs）、D-二聚體（D-D），血小板功能分析儀（PFA-100）、血栓彈力圖（TEG）的檢測(cè)其臨床應(yīng)用作一簡(jiǎn)述。,圖1

2、 血管內(nèi)皮細(xì)胞與止血系統(tǒng),（一）一期出血缺陷篩檢試驗(yàn)的應(yīng)用,1.一期止血缺陷 是指血管壁和血小板異常所引起的止血功能缺陷，主要是由于毛細(xì)血管壁通透性、脆性增加或血小板數(shù)量、質(zhì)量異常所致的出血。,2.臨床特點(diǎn) 出血以皮膚、黏膜為主，重者可伴有內(nèi)臟出血；但肌肉、關(guān)節(jié)等組織出血罕見。 對(duì)壓迫、縫合、外用止血?jiǎng)┗蜉斪⒀“逯委熡行?，但?duì)血漿和血漿凝血因子制品無效。3.篩選試驗(yàn) 出血時(shí)間（BT） 血小板計(jì)數(shù)（PLT）

3、,篩選試驗(yàn)1.出血時(shí)間（BT，模板式刀片法/出血時(shí)間測(cè)定器法）反映毛細(xì)血管壁與血小板相互作用：毛細(xì)血管的完整性、收縮性以及血小板數(shù)量、功能的實(shí)驗(yàn)。參考范圍：TBT法：6.9±2.1 min,臨床意義：BT延長(zhǎng)（＞9.0min）（1）PLT↓與BT↑呈負(fù)相關(guān)，PLT愈↓BT愈↑。（2）血小板功能異常：血小板無力癥、巨血小板綜合征、灰色血小板綜合征等。（3）部分凝血因子缺乏：低/無纖維蛋白原血癥、血管性血友?。╲WD）等

4、。（4）遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥。（5）藥物：阿司匹林（ASA）、氯吡格雷（玻立維）和阿昔單抗等。,方法學(xué)評(píng)價(jià) 上海瑞金醫(yī)院對(duì)126例ITP和20例vWD患者檢測(cè)BT結(jié)果列于表1；對(duì)BT的三種方法比較見表2。 表1 ITP和vWD應(yīng)用兩種BT法檢測(cè)的結(jié)果,* P＜0.01,表2 三種BT檢測(cè)方法的比較,2.血小板計(jì)數(shù)（PLT） 單位容積的循環(huán)血液中所含血小板的數(shù)量 （×109/L ）

5、。方法：（1）直接血小板計(jì)數(shù)法（普通顯微鏡法/相差顯微鏡法）；（2）血液分析儀（電阻抗法/光散射法）；（3）流式細(xì)胞儀法。參考范圍：國(guó)內(nèi)：85～320 ×109/L （成人）；通常是100 ～300 ×109/L 。,臨床意義（1）血小板減少（＜100 ×109/L ）：PLT＞50 ×109/L ，出血少見；50～30 ×109/L，外傷性出血；＜20×109/L

6、 ，自發(fā)性出血，常需輸注血小板制品。 血小板減少原因：生成減少、破壞增多、消耗過多、分布異常等。（2）血小板增多（ ＞ 400 ×109/L ）：PLT400 ～600 ×109/L，需觀察；PLT ＞ 600 ×109/L，需治療； PLT＞ 600 ×109/L ，需血小板分離。血小板增多原因：骨髓增生性疾病、反應(yīng)性血小板增多。,方法學(xué)評(píng)價(jià) ICSH推薦：一般用血涂片法觀察血小板分

7、布并與計(jì)數(shù)核實(shí)。（1）草酸胺稀釋-相差顯微鏡計(jì)數(shù)血小板；（2）流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)。 經(jīng)國(guó)際11個(gè)實(shí)驗(yàn)室用CD41、CD61驗(yàn)證，該法準(zhǔn)確度、精密度很好，可作為自動(dòng)血細(xì)胞分析儀的校準(zhǔn)和PLT減少的準(zhǔn)確性的驗(yàn)證。,圖 2 一期止血缺陷的篩選試驗(yàn),圖3 先天性初期止血異常的實(shí)驗(yàn)室檢查,獲得性初期止血異常的實(shí)驗(yàn)室檢查,（二）二期止血缺陷篩檢試驗(yàn)的應(yīng)用,1.二期止血缺陷 是指凝血障礙和抗凝物質(zhì)所引起的止血功能缺陷，主要是由于凝血因子缺乏

8、或體內(nèi)產(chǎn)生病理性抗凝物質(zhì)所致出血。,2.臨床特點(diǎn) 出血以肌肉、關(guān)節(jié)為特點(diǎn)、也可有內(nèi)臟、皮膚出血 對(duì)血漿、血漿凝血因子制品有效，但對(duì)壓迫、外用止血?jiǎng)┖洼斞“瀵熜芳选?.篩選試驗(yàn) 活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT） 血漿凝血酶原時(shí)間（PT）,圖 4 凝血系統(tǒng)及其篩選實(shí)驗(yàn),1.活化的部分凝血活酶時(shí)間（APTT） APTT是內(nèi)源凝血途徑的常用和較敏感的篩選試驗(yàn)。參考范圍：傳統(tǒng)的是31～43s；目前隨著儀器和試

9、劑的開發(fā)，其參考值不一，尚難統(tǒng)一。正常對(duì)照值：傳統(tǒng)的須測(cè)對(duì)照值，以測(cè)定值較對(duì)照值延長(zhǎng)＞10s為異常；目前也未統(tǒng)一。APTTR：患者APTT/正常對(duì)照APTT比值，尚未得出參考范圍，尚未推廣應(yīng)用。,臨床意義（1）內(nèi)源性凝血途徑因子缺陷：FⅧ（血友病A）、FⅨ（血友病B）、FⅪ、FⅫ、PK和HMWK等遺傳性缺乏癥。（2）內(nèi)源性凝血途徑因子抑制物存在：常見FⅧ、 FⅨ抑制物，狼瘡抗凝物（LA），應(yīng)選用鞣花酸為激活劑更敏感。（3）藥

10、物所致異常：常見肝素（患者APTT/正常人APTT比值為1.5～2.5為治療范圍）、輸注庫(kù)血引起凝血病等。（4）纖溶活性增強(qiáng)：尤其是多見于繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)（DIC），而原發(fā)性纖溶很少延長(zhǎng)。,方法學(xué)評(píng)價(jià)（1）激活劑：白陶土、硅藻土和鞣花酸的敏感性比較，見表3 表 3 不同激活劑對(duì)APTT敏感度比較,（2）凝血時(shí)間檢測(cè)的敏感性比較：瑞金醫(yī)院對(duì)血友病患者凝血時(shí)間的敏感度作比較,延長(zhǎng)率（%）：APTT 95%，硅管法CT100%

11、，ACT100%，而試管法CT為70%，故目前用APTT為篩選實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、方便、實(shí)用。,2、血漿凝血酶原時(shí)間（PT） PT是外源凝血系統(tǒng)常用和較為敏感的篩選實(shí)驗(yàn)。參考范圍：傳統(tǒng)法為12 ± 1s（11～13s）；目前，隨著儀器和試劑不同，參考范圍也有不同。尚未統(tǒng)一。正常對(duì)照組：傳統(tǒng)法為測(cè)定值較正常對(duì)照組＞3s為異常，目前也未統(tǒng)一。PTR 參考范圍：1.00 ±0.05，已在應(yīng)用。,臨床意義（1）PT延長(zhǎng)

12、：見于遺傳性/獲得性外源凝血系統(tǒng)的凝血因子缺乏；獲得性常見于DIC、依K因子缺乏、口服抗凝劑、肝??；循環(huán)血抗凝物質(zhì)：肝素、FDP、抗因子抗體。（2）PT-INR 多用于監(jiān)測(cè)口服抗凝劑（華法林）。INR＜1.5提示抗凝劑無效；INR 1.5～2. 0 用于預(yù)防；INR 2.0 ～2. 5 常規(guī)抗凝； INR2.5 ～3.0 重度抗凝；INR ＞3.0 易致出血。,方法學(xué)評(píng)價(jià)（1）Hct＜30%或＞50%，抗凝劑和血液的比例應(yīng)按下式調(diào)整

13、（表4）抗凝劑量（mL）=（100-Hct）×血液量（ mL） ×0.00185 表 4 Hct對(duì)PT和APTT測(cè)定結(jié)果的影響,,（2）凝血活酶（組織因子）：兔腦、人腦、重組組織因子（rTF）對(duì)PT的結(jié)果，不盡相同。 rTF ＞人腦＞兔腦（3）緩沖劑 其維持血漿pH，防止易變因子失活；如果無緩沖劑，血漿pH增加，PT延長(zhǎng)。,（三）、篩選試驗(yàn)的聯(lián)合應(yīng)用,主要是PT、APTT和PLT的聯(lián)合應(yīng)用。,1）PT（

14、N）、APTT和PLT（N）,2）PT（↑）、APTT（N）和PLT（N）,3）PT（↑）、APTT（↑）和PLT（N）,4）PT（↑）、APTT（↑）和PLT（↓）,5）PT（N）、APTT（N）和PLT（↑）,6）有出血癥狀，但PT（N），APTT（N）和PLT（N）,圖 3 先天性凝血異常的實(shí)驗(yàn)室檢查,表 獲得性凝血性障礙項(xiàng)目的選擇和應(yīng)用,（四）纖溶活性增強(qiáng)篩選試驗(yàn)的應(yīng)用,1、原發(fā)性纖溶性增強(qiáng) 指組織型纖溶酶原激活物（t-PA

15、）或尿激酶型纖溶酶原活物（u-PA）的活性增強(qiáng)所致纖溶性亢進(jìn)2、繼發(fā)性纖溶活性增強(qiáng) 幾乎都見于DIC，是指因子Ⅻa激活激肽釋放酶原（PK）生成激肽釋放酶（KK），KK激活纖溶系統(tǒng)所致纖溶活性增強(qiáng)。,3、篩選試驗(yàn)纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物（FDP）測(cè)定D-二聚體測(cè)定（D-D）,圖5 FDP和D-D的生成,1、纖維蛋白原（Fg）和纖維蛋白（Fb）降解產(chǎn)物（FDPs）測(cè)定 指纖溶酶同時(shí)降解Fg和Fb產(chǎn)生的FDPs。（1）定性試

16、驗(yàn)：膠乳凝集法。陰性：血清FDP含量＜10μg/mL，血漿FDP含量＜5μg/mL，尿液FDP含量＜2μg/mL。陽(yáng)性：血清FDP含量≥10μg/mL，血漿FDP含量≥ 5μg/mL，尿液FDP含量≥ 2μg/mL。,（2）定量試驗(yàn)：ELISA法。包被于固相的FDP抗體與樣本中FDP（抗原）結(jié)合，加入酶標(biāo)抗體后形成夾心復(fù)合物，呈顯色反應(yīng)。 參考值：＜5 μg/mL。,2、D-二聚體（D-D）測(cè)定 指纖溶酶特異性降解纖維蛋白

17、（Fb）所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。（1）定性試驗(yàn)：膠乳凝集試驗(yàn)。陰性：無凝集顆粒者，即D-D含量＜0.5μg/mL陽(yáng)性：有凝集顆粒者，即D-D含量≥0.5μg/mL半定量：以＜0.5μg/mL、 ≥0.5μg/mL×陽(yáng)性時(shí)的最大稀釋倍數(shù)。,（2）定量試驗(yàn)：ELISA法。 參考范圍： ＜0.5μg/mL（3）定量試驗(yàn)：膠體金法。將血漿加入檢測(cè)卡孔內(nèi)，血漿中D-D吸附于包被有D-D單抗膜中，再加入D-D單抗-膠體金耦聯(lián)物

18、溶液，膜中D-D將與金標(biāo)抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，用光筆閱讀儀讀數(shù)。 參考范圍： ＜0.3 mg/L,臨床應(yīng)用（1）纖溶活性增強(qiáng)篩檢試驗(yàn)的應(yīng)用 FDP正常，D-D正常：多數(shù)為正常人，提示無纖溶過度現(xiàn)象。 FDP陽(yáng)性，D-D正常：多數(shù)為FDP的假陽(yáng)性或原發(fā)性纖溶癥。 FDP正常，D-D陽(yáng)性：多數(shù)為FDP假陰性或繼發(fā)性纖溶癥。 FDP陽(yáng)性，D-D陽(yáng)性：多數(shù)為繼發(fā)性纖溶癥，常見于DIC。,（2）在診斷DIC中的應(yīng)用 見

19、表 5 表5 FDP和D-D在診斷DIC中的應(yīng)用,(3)D-D在排除靜脈血栓（VTE）中的應(yīng)用 D-D測(cè)定在排除VTE中有重要價(jià)值（表6）。 表 6 D-D測(cè)定在排除VTE中的應(yīng)用,方法學(xué)評(píng)價(jià)（1）對(duì)VTE的診斷：D-D測(cè)定有高度敏感性和陰性預(yù)測(cè)值，但特異性較低。因此，D-D測(cè)定陰性可排除VTE，陽(yáng)性不一定是VTE。（2）D-D測(cè)定，WHO規(guī)定用ELISA法，臨界值為500 μg/L。因此D-D測(cè)定值＜500 μ

20、g/L排除VTE，幾乎為100%，＞ 500 μg/L診斷VTE的可能性為40%，必須結(jié)合其他影象檢查。,（3）D-D測(cè)定陰性時(shí)，結(jié)合臨床低/中危險(xiǎn)度，其排除價(jià)值更大；D-D測(cè)定陽(yáng)性時(shí)，結(jié)合臨床高危險(xiǎn)度和影象檢查診斷價(jià)值更大。（4）FDP和D-D陽(yáng)性可見于老年人、妊娠、癌腫、DIC、肝病、感染、炎癥、創(chuàng)傷、手術(shù)、溶栓治療、冠心病等。判斷結(jié)果時(shí)要充分考慮。,（五）DIC篩選試驗(yàn)的應(yīng)用,診斷DIC必須符合下列4項(xiàng)：（1）引起DIC的基

21、礎(chǔ)疾?。翰∫蛟\斷（2）有DIC的臨床表現(xiàn)：臨床診斷（3）DIC的實(shí)驗(yàn)室檢查：實(shí)驗(yàn)診斷（4）對(duì)肝素治療有效：治療診斷,臨床應(yīng)用1、國(guó)外DIC的記分診斷標(biāo)準(zhǔn)（表9）,2、國(guó)外DIC的記分診斷標(biāo)準(zhǔn)（表10）,3、日本厚生省DIC診斷記分標(biāo)準(zhǔn) 表11,注：計(jì)分＞7分確診DIC，計(jì)分6可疑DIC，＜5則可能性少，可疑時(shí)補(bǔ)做：Sfmc、DD、TAT、PAP，動(dòng)態(tài)plt，抗凝治療有效,4、國(guó)內(nèi)基層單位DIC診斷標(biāo)準(zhǔn)（1999）對(duì)臨床懷疑，

22、有下列7項(xiàng)中3項(xiàng)即可診斷DIC（1）PLT＜50×109/L或進(jìn)行性↓（2）Fg ＜1.5g/L或≥4.0g/L，且呈進(jìn)行性變 化（3）3P試驗(yàn)（+）或FDP ≥20mg/L（4）PT縮短/延長(zhǎng)＞3s，或呈動(dòng)態(tài)變化（5）外周血涂片破碎紅細(xì)胞＞10%（6）ESR ＜15mm/h（7）血凝塊在2h內(nèi)出現(xiàn)溶解現(xiàn)象,方法學(xué)評(píng)價(jià)1、DIC常用實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的評(píng)價(jià)（表7）,2、DIC聯(lián)合實(shí)驗(yàn)指標(biāo)分析（表8）,方法學(xué)評(píng)價(jià)

23、 見表7、表8。我院對(duì)864例DIC患者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，它們的敏感性、特異性和診斷準(zhǔn)確率分別為60%、66%和63%；對(duì)DIC前期109例患者的敏感性、特異性和診斷準(zhǔn)確率分別為80%、68%和74%。Wada等（2003）DIC的診斷標(biāo)準(zhǔn)作了前瞻性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示：敏感性為91%，特異性為97%。由此可見，所用DIC實(shí)驗(yàn)診斷指標(biāo)，基本上可以滿足臨床需求。,（六）自動(dòng)化儀器在血栓 與止血篩選試驗(yàn)中的應(yīng)用,1、血

24、栓彈力圖（thrombelastograph，TEG） 承載全血標(biāo)本的測(cè)試杯以4º45’左右擺動(dòng)，當(dāng)杯中凝血啟動(dòng)，置于杯中的金屬針受到凝血塊生成/溶解的切應(yīng)力作用，隨之一起擺動(dòng)。金屬針在擺動(dòng)過程中所產(chǎn)生的電流，經(jīng)電腦軟件處理后，便形成曲線。這種儀器稱血栓彈力儀，所形成的曲線稱血栓彈力圖（TEG）,圖6 TEG各參數(shù)的形成,表 12 TEG主要參數(shù)及其含量,臨床應(yīng)用,（1）判斷凝血狀態(tài)：低凝、高凝狀態(tài) 低凝狀態(tài)：R、K值

25、都延長(zhǎng) 高凝狀態(tài)：R、K值都縮短 指導(dǎo)血漿制品的選擇（2）判斷肝素/LMWH療效：有效、過量、抵抗 普通檢測(cè)R、K值=肝素R、K值，示無肝素存在 普通檢測(cè)R、K值＞肝素R、K值，示有肝素存在 指導(dǎo)肝素/LMWH使用和魚精蛋白中和,（3）判斷抗血小板治療：有效、過量、抵抗 用TEG的血小板定位圖（platelet mapping）。 使用抗血小板藥后血小板抑制率＜20%為抵抗。 使用抗血小板藥后血小板抑制

26、率50%～75%為有效。（4）評(píng)估非心臟手術(shù)后血栓事件的發(fā)生率 應(yīng)該維持MA值＜67mm將大大降低血栓事件 若MA值＞ 67 ～72mm，血栓發(fā)生率為16%。 若MA值＞ 72 ～95mm，血栓發(fā)生率為32%。,（5）評(píng)估PCI后血栓事件的發(fā)生機(jī)率 若PCI后，MA值＞65～68mm，發(fā)生率為10%。 若PCI后，MA值＞68～72mm，發(fā)生率為14%。 若PCI后，MA值＞72mm，發(fā)生率為60%。（6）其

27、他應(yīng)用 區(qū)別原發(fā)性纖溶和繼發(fā)性纖溶（DIC） 判斷高凝狀態(tài)原因：凝血亢進(jìn)、血小板活性↑ 鑒別手術(shù)出血：外科出血、內(nèi)科出血,2.血小板功能分析儀（platelet function analyzer-100,PFA-100) 體外篩選血小板黏附和聚集的儀器。以標(biāo)有膠原/腺上腺素（CEPI）和膠原/ADP（CADP）兩種纖維膜為誘導(dǎo)劑，以觀察膜孔閉合時(shí)間（closure time，CT）為結(jié)果。參考范圍 CEPI為61～20

28、3s；CADP：48 ～187s,,,,,,,,,,,In Vivo Haemostasis,PFA100.avi,,,capillary 200µm,aperture150µm,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,epinephrine or ADP,platelet,vWF,erythrocyte,,,,,,FLOW,,,- 40 mbar,,,collagen,membrane,,,,,,,,

29、PFA-100® Test Principle,lumen,fibrinogen,platelet,collagen fibrils,erythrocyte,endothelial cell,vWF,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,臨床應(yīng)用 一期止血缺陷的篩選試驗(yàn)。敏感性：CEPI/CADP為82.5%/66.9%特異性：

30、 CEPI/CADP為88.7%/85.5%陰性預(yù)測(cè)值： CEPI/CADP為83%/75%陽(yáng)性預(yù)測(cè)值： CEPI/CADP為88%/79%,vWD：CEPI/CADP的敏感性為88%/87%；特異性為95%/95%。血小板無力癥：CT延長(zhǎng)，可替代BT，準(zhǔn)確、可靠。服用ASA時(shí)：CEPI的CT延長(zhǎng)，CADP可正常；與其他疾病與藥物誘導(dǎo)血小板功能異常鑒別的敏感性和特異性分別為100%和50%。,方法學(xué)評(píng)價(jià) PF

31、A-100操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果準(zhǔn)確。CEPI/CADP的變異系數(shù)為12%/8%，與PAgT有良好相關(guān)性。 受PLT↓、貧血（Hct＜30%）、O型血型、3.8%枸櫞酸鹽和富含核黃素食物等的影響；Fg的裂解肽可影響 Fg-vWF/GPⅡb-Ⅲa的結(jié)合,圖 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的全面質(zhì)量管理注：分析測(cè)定包括：工作環(huán)境、人員素質(zhì)、室間質(zhì)評(píng)、室內(nèi)質(zhì)控、儀器設(shè)備、操作標(biāo)準(zhǔn)、試劑準(zhǔn)備、方法選擇。,,,分析中質(zhì)量保證,謝謝，請(qǐng)指導(dǎo)。