基因診斷和基因治療

1、生物化學(xué)與分子生物學(xué),第二十五章基因診斷和基因治療,Gene Diagnosis and Gene Therapy,第一節(jié)基 因 診 斷,Gene Diagnosis,基因診斷的優(yōu)勢(shì)：,① 可在源頭上識(shí)別基因正常與否，屬于“病因診斷”② 針對(duì)特定基因，特異性強(qiáng)③ 所用的PCR等技術(shù)具有放大效應(yīng)，故靈敏度高④ 適用性強(qiáng)，診斷范圍廣,是指利用分子生物學(xué)技術(shù)和方法直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方

2、法。,基因診斷的定義：,、基因診斷的主要對(duì)象和樣品來源,主要是DNA分子，涉及到功能分析時(shí)，還可定量檢測(cè)RNA（主要是mRNA）和蛋白質(zhì)等分子。,臨床上可用于基因診斷的樣品有血液、組織塊、羊水和絨毛、精液、毛發(fā)、唾液和尿液等。,對(duì)象：,樣品來源：,二、基因診斷技術(shù),分類,定性分析,定量分析,基因分型,檢測(cè)基因突變,測(cè)定基因拷貝數(shù),測(cè)定基因表達(dá)產(chǎn)物量,基本流程：,基因診斷的基礎(chǔ),,,,核酸分子雜交,DNA序列分析技術(shù),幾種技術(shù)聯(lián)合使用,,

3、（一）基因缺失或插入的診斷,1．DNA印跡法,其可以區(qū)分正常和突變樣品的基因型，并可獲得基因缺失或插入片段大小等信息。DNA印跡一般可以顯示50 bp～20 kbp的DNA片段，片段大小的信息是該技術(shù)診斷基因缺陷的重要依據(jù)。,2．PCR法,裂口PCR（gap-PCR），簡(jiǎn)便靈敏而更適用于臨床診斷。該方法的思路是：設(shè)計(jì)并合成一組序列上跨越突變（缺失或插入）斷裂點(diǎn)的引物，從擴(kuò)增片段的大小直接判斷是否存在缺失或插入突變。,（二）基因點(diǎn)突變的診

4、斷,1．等位基因特異性寡核苷酸分子雜交,檢測(cè)點(diǎn)突變的有效技術(shù)是等位基因特異性寡核苷酸（allele specific oligonucleotide，ASO）分子雜交。,2．反向點(diǎn)雜交,反向點(diǎn)雜交（reverse dot blot，RDB）是改進(jìn)的 ASO技術(shù)。一次檢測(cè)可以同時(shí)篩查多種突變，大大提高了基因診斷效率 。,3．變性高效液相色譜,DHPLC技術(shù)的基本原理是利用待測(cè)樣品DNA在PCR擴(kuò)增過程的單鏈產(chǎn)物可以隨機(jī)與互補(bǔ)鏈相結(jié)合而形成

5、雙鏈的特性，依據(jù)最終產(chǎn)物中是否出現(xiàn)異源雙鏈來判斷待測(cè)樣品中是否存在點(diǎn)突變。,4．DNA序列分析,用于基因突變類型已經(jīng)明確的遺傳病的診斷及產(chǎn)前診斷。,三、基因診斷的醫(yī)學(xué)應(yīng)用,（一）遺傳性疾病診斷和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè),基因診斷目前可用于遺傳篩查和產(chǎn)前診斷。,我國(guó)部分代表性常見單基因遺傳病基因診斷,（二）多基因常見病的預(yù)測(cè)性診斷,預(yù)測(cè)性診斷可為被測(cè)者提供某些疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估意見。,（三）傳染病病原體檢測(cè),適用情況,① 病原微生物的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，確定感

6、染源；② 病毒或致病菌的快速分型，明確致病性或藥物敏感性；③ 需要復(fù)雜分離培養(yǎng)條件，或目前尚不能體外培養(yǎng)的病原微生物的鑒定。,（四）療效評(píng)價(jià)和用藥指導(dǎo),PCR等基因診斷技術(shù)已成為臨床上檢測(cè)和跟蹤微小殘留病灶的常規(guī)方法。在系統(tǒng)闡明人類藥物代謝酶類及其他相關(guān)蛋白的編碼基因遺傳多態(tài)性的基礎(chǔ)上，通過對(duì)不同藥物代謝基因靶點(diǎn)的藥物遺傳學(xué)檢測(cè)，將為真正實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥提供技術(shù)支撐。,,（五）DNA指紋鑒定是法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別的核心技術(shù),人與人之間的

7、某些DNA序列特征具有高度的個(gè)體特異性和終生穩(wěn)定性，正如人的指紋一般，故稱為DNA指紋（DNA fingerprinting）。,STR等位基因在家庭中遺傳示意圖,第二節(jié)基 因 治 療,Gene Therapy,是以改變?nèi)诉z傳物質(zhì)為基礎(chǔ)的生物醫(yī)學(xué)治療，即通過一定方式將人正?；蚧蛴兄委熥饔玫腄NA片段導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以矯正或置換致病基因的治療方法。它針對(duì)的是疾病的根源，即異常的基因本身。,基因治療的定義,一、基因治療的基本策略,

8、（一）缺陷基因精確的原位修復(fù),基因矯正gene correction,基因置換gene replacement,致病基因的突變堿基進(jìn)行糾正,用正?；蛲ㄟ^重組原位替換致病基因,這兩種方法屬于對(duì)缺陷基因精確的原位修復(fù)，既不破壞整個(gè)基因組的結(jié)構(gòu)，又可達(dá)到治療疾病的目的，是最為理想的治療方法。,（二）基因增補(bǔ),不刪除突變的致病基因，而在基因組的某一位點(diǎn)額外插入正常基因，在體內(nèi)表達(dá)出功能正常的蛋白質(zhì)，達(dá)到治療疾病的目的。這種對(duì)基因進(jìn)行異位替

9、代的方法稱為基因添加（gene augmentation）或稱基因增補(bǔ)，是目前臨床上使用的主要基因治療策略。,（三）基因沉默或失活,有些疾病是由于某一或某些基因的過度表達(dá)引起的，向患者體內(nèi)導(dǎo)入有抑制基因表達(dá)作用的核酸，如反義RNA、核酶、干擾小RNA等，可降解相應(yīng)的mRNA或抑制其翻譯，阻斷致病基因的異常表達(dá)，從而達(dá)到治療疾病的目的。這一策略稱為基因失活（gene inactivation）或基因沉默（gene silencing）。,

10、二、基因治療的基本程序,基因治療的基本過程可分為5個(gè)步驟：,① 選擇治療基因② 選擇攜帶治療基因的載體③ 選擇基因治療的靶細(xì)胞④ 在細(xì)胞和整體水平導(dǎo)入治療基因⑤ 治療基因表達(dá)的檢測(cè),（一）選擇治療基因,許多分泌性蛋白質(zhì)如生長(zhǎng)因子、多肽類激素、細(xì)胞因子、可溶性受體（人工構(gòu)建的去除膜結(jié)合特征的受體），以及非分泌性蛋白質(zhì)如受體、酶、轉(zhuǎn)錄因子的正?；蚨伎勺鳛橹委熁?。簡(jiǎn)言之，只要清楚引起某種疾病的突變基因是什么，就可用其對(duì)應(yīng)的正?；?/p>

11、或經(jīng)改造的基因作為治療基因。,（二）選擇攜帶治療基因的載體,基因治療用載體有病毒載體和非病毒載體兩大類，多選用病毒載體。,野生型病毒必須經(jīng)過改造，剔除其復(fù)制必需的基因和致病基因，消除其感染和致病能力。,目前用作基因轉(zhuǎn)移載體的病毒有逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）、腺病毒（adenovirus）、腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus, AAV）、單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）等。,1

12、. 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,逆轉(zhuǎn)錄病毒屬于RNA病毒，其基因組中有編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶（integrase）的基因。,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有基因轉(zhuǎn)移效率高、細(xì)胞宿主范圍較廣泛、DNA整合效率高等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)一是有感染性病毒的可能；二是增加了腫瘤發(fā)生機(jī)會(huì)。,2. 腺病毒載體,腺病毒屬DNA病毒，可引起人上呼吸道和眼部上皮細(xì)胞的感染。,安全性高,轉(zhuǎn)染效率高,可用細(xì)胞范圍廣,缺點(diǎn),基因組較大，構(gòu)建復(fù)雜,不能長(zhǎng)期表達(dá),免疫原性較強(qiáng)，易被排斥,優(yōu)點(diǎn),,,（三）

13、選擇基因治療的靶細(xì)胞,靶細(xì)胞通常是體細(xì)胞（somatic cell），包括病變組織細(xì)胞或正常的免疫功能細(xì)胞。,1. 造血干細(xì)胞 ：造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）是骨髓中具有高度自我更新能力的細(xì)胞，能進(jìn)一步分化為其他血細(xì)胞，并能保持基因組DNA的穩(wěn)定。,2. 皮膚成纖維細(xì)胞：皮膚成纖維細(xì)胞具有易采集、可在體外擴(kuò)增培養(yǎng)、易于移植等優(yōu)點(diǎn)。,3. 肌細(xì)胞：肌細(xì)胞有特殊的T管系統(tǒng)利于注射的質(zhì)粒DNA經(jīng)內(nèi)吞作用

14、進(jìn)入。環(huán)狀質(zhì)粒不整合入基因組DNA，能在肌細(xì)胞內(nèi)較長(zhǎng)時(shí)間保留。,（四）將治療基因?qū)肴梭w,將外源基因直接注入體內(nèi)有關(guān)的組織器官，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)。,基因遞送gene delivery,間接體內(nèi)療法ex vivo,直接體內(nèi)療法in vivo,將需要接受基因的靶細(xì)胞從體內(nèi)取出，在體外培養(yǎng)，將攜帶有治療基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，篩選出接受了治療基因的細(xì)胞，繁殖擴(kuò)大后再回輸體內(nèi)，使治療基因在體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物。,基因?qū)爰?xì)胞,生物學(xué)

15、法,非生物學(xué)法,病毒載體所介導(dǎo)的基因?qū)?，是通過病毒感染細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的，其特點(diǎn)是基因轉(zhuǎn)移效率高，但安全問題需要重視。,用物理或化學(xué)法，將治療基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)或直接導(dǎo)入人體內(nèi)，操作簡(jiǎn)單、安全，但是轉(zhuǎn)移效率低。,（五）治療基因表達(dá)的檢測(cè),無論以何種方法導(dǎo)入基因，都需要檢測(cè)這些基因是否能被正確表達(dá)。被導(dǎo)入基因的表達(dá)狀態(tài)可以用PCR、RNA印跡、蛋白印跡及ELISA等方法去檢測(cè)。對(duì)于導(dǎo)入基因是否整合到基因組以及整合的部位，可以用DNA印跡技術(shù)

16、進(jìn)行分析。,三、基因治療的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀,1. 單基因遺傳病的基因治療,只受一對(duì)等位基因影響而發(fā)生的疾病屬于單基因遺傳病，設(shè)計(jì)基因治療方案相對(duì)容易，例如鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血、α-地中海貧血、血友病等?；痉桨甘峭ㄟ^一定的方法把正常的基因?qū)氲讲∪梭w內(nèi)，表達(dá)出正常的功能蛋白。,2.針對(duì)多基因病的基因治療,由多個(gè)基因相互作用結(jié)果，并受環(huán)境因素影響而發(fā)生的疾病屬于多基因病，如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、腫瘤等。,惡性腫瘤的基因治療包括：針對(duì)癌基