肝靶向基因治療AAV載體的篩選及其在OTCD基因治療中的應用.pdf

1、背景：
　　 腺相關病毒(Adeno-associated virus，AAV)為單鏈DNA病毒，屬于細小病毒科(Parvoviridae)依賴病毒屬(Dependovirus)。基因組全長～4.7 kb，不具有致病性及任何病理癥狀，需要輔助病毒的協(xié)助才能完成復制。自上個世紀六十年代初AAV2被首次發(fā)現(xiàn)以來，已從靈長類動物體內(nèi)分離、鑒定出110多種AAV。早期研究證實AAV2載體能夠在多種組織細胞內(nèi)持續(xù)表達轉(zhuǎn)基因，且沒有載體相關

2、毒性和宿主免疫反應。但是，隨后的研究發(fā)現(xiàn)AAV2有限的靶組織特異性、較低的轉(zhuǎn)基因效率、遲緩的基因表達以及人群中和抗體(neutralizing antibody，NAb)等因素限制了其在基因治療中的廣泛應用。已有多個研究表明，來源于靈長類動物的新型AAV載體具有轉(zhuǎn)導效率高、血清流行率低、免疫反應弱等優(yōu)點。特別是AAV7、8、9等新型載體，在肝臟轉(zhuǎn)基因方面的表現(xiàn)尤為突出。近年來，隨著交叉包裝以及自身互補型AAV(Self-compleme

3、ntary AAV，scAAV)載體技術的發(fā)展，使得這些新型AAV廣泛應用于肌肉、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Centralnervous system，CNS)、肝臟等組織的基因治療研究當中。
　　 鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶(Ornithine Transcarbamylase，OTC)為線粒體基質(zhì)同型三聚體酶，其在尿素循環(huán)系統(tǒng)中的主要作用是催化氨甲酰磷酸鹽和鳥氨酸合成瓜氨酸。鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶缺乏癥(OrnithineTranscarbam

4、ylase Deficiency，OTCD)是一種X連鎖半顯性遺傳疾病，主要是由于OTC基因突變而引起，發(fā)病率約為1/14，000。目前，已經(jīng)從人類OTC基因內(nèi)鑒定出341個致病突變和29個非致病突變。OTCD表型具有多樣性，OTC完全缺失的半合子男性患兒一般在出生后1個星期內(nèi)出現(xiàn)急性高氨血癥，而雜合子女性患兒和OTC部分缺失的男性患兒則在嬰兒后期乃至成人期發(fā)病。OTCD的臨床癥狀主要包括由高氨血癥引起的嗜睡、嘔吐、抽搐或肢體行為異常，

5、更嚴重者會昏迷，腦水腫或死亡。理化特征為血漿中谷氨酸濃度上升，瓜氨酸濃度降低或檢測不到，尿液中乳清酸濃度上升。目前，OTCD的治療手段主要是嚴格監(jiān)護、長期控制飲食蛋白并結合苯丁酸鈉旁路治療來控制病情，徹底矯正OTC活性的治療方式只能通過肝移植來實現(xiàn)。
　　 目的：
　　 分別以小鼠和非人靈長類動物(non-human primate，NHP)為模型，對肝靶向轉(zhuǎn)基因AAV載體進行全面、系統(tǒng)的評估和篩選，并將該載體應用于OT

6、CD基因治療的研究。
　　 方法：
　　 首先以小鼠為動物模型，從轉(zhuǎn)基因效率、轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定性、肝臟毒性、血清NAb、免疫反應以及組織分布等方面，對7種用于肝臟基因治療新型AAV載體(AAV8，6.2，7，rh.64R1，hu.37，rh.8，rh.32.33)的生物學特性進行全面系統(tǒng)的評估。然后在此基礎上選出3種載體，在NHP中(恒河猴)做進一步的評估，以期選出最適于臨床肝臟轉(zhuǎn)基因AAV載體。
　　 將上述新型AA

7、V8衣殼結合scAAV載體技術，構建AAV2/8.sc.TBG.mOTC載體，以Spf-ash小鼠為模型，從尿液乳清酸、肝臟OTC活性、OTC蛋白表達、NH4Cl攻擊試驗以及載體分布等方面評價該載體在OTCD基因治療中的效率。同時以新生C57Bl/6小鼠(<24小時)為模型，初步探索scAAV載體的轉(zhuǎn)基因效率和穩(wěn)定性。
　　 結果：
　　 1、通過對7種用于肝臟基因治療新型AAV載體(AAV8，6.2，7，rh.64R1

8、，hu.37，rh.8，rh.32.33)在小鼠體內(nèi)的系統(tǒng)評估，綜合分析各種載體在轉(zhuǎn)基因效率、轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定性、肝臟毒性、血清NAb、免疫反應以及組織分布等方面的表現(xiàn)，從分數(shù)上可將7種載體分為高、中、低3組：高-AAVhu.37(1.5)和AAVrh.8(0.5)；中-AAV8(-2)、AAVrh.64R1(-2)、AAV7(-4)；低-AAV6.2(-12)和AAVrh.32.33(-17.5)。
　　 2、本研究的最初目的是以恒

9、河猴為模型，對3種AAV(AAV8、hu.37、rh.8)的肝臟轉(zhuǎn)基因效率和安全性做進一步的評價。但在試驗過程中我們發(fā)現(xiàn)，由于自然感染而產(chǎn)生的低水平AAV NAb對載體的轉(zhuǎn)基因作用產(chǎn)生了嚴重的影響。AAV8轉(zhuǎn)導效率與先存NAb間的關系相對清晰，即使1：5的NAb便可影響載體在恒河猴體內(nèi)的轉(zhuǎn)導。但本研究未能總結出AAVhu.37、AAVrh.8 NAb與轉(zhuǎn)導效率間的關系。這是因為現(xiàn)有NAb分析方法(體外/體內(nèi))無法準確的檢測出以上兩種AA

10、V的實際NAb水平。本研究發(fā)現(xiàn)抗原性轉(zhuǎn)基因綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)在研究期限內(nèi)(35天)能夠獲得持續(xù)的表達。這可能是由于肝臟特異性TBG啟動子的使用，在一定程度上避免了細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic Tymphocyte cell，CTL)對多數(shù)動物體內(nèi)GFP轉(zhuǎn)導細胞的殺傷作用。因此，從現(xiàn)有的研究結果來看，AAV8最適于作為臨床肝臟基因治療載體，這是因為：1)轉(zhuǎn)導效率最高；2)目前

11、的分析方法能夠有效的檢測其NAb。
　　 3、AAV2/8.sc.TBG.mOTC1.1載體具有較快的起效時間，并起到一定的治療作用。注射Spf-ash小鼠3天后尿液乳清酸水平開始下降，7天后恢復至正常值。肝臟OTC活性也于7天后開始明顯升上，14天后達到正常值的35.4％，此時Spf-ash小鼠對NH4Cl攻擊的抵抗能力也基本達到正常小鼠水平。通過對mOTC基因表達盒的優(yōu)化，使載體的效率進一步提高。注射載體14天后，肝臟OTC

12、活性為正常小鼠的1.5倍，OTC陽性細胞>80％。
　　 4、AAV2/8.sc.TBG.EGFP載體能夠在新生小鼠(<24小時)肝臟內(nèi)高效表達GFP。特別是在高劑量組中(2×1011GC)，載體注射后3天GFP陽性細胞超過85％。但1個星期后，隨著肝細胞大量增殖而導致GFP表達水平開始逐漸下降，至第3個星期GFP僅存5％左右，并穩(wěn)定維持在該水平直至第5個星期。這些結果表明：(1) scAAV2/8載體能夠在新生小鼠肝臟內(nèi)迅速高

13、效的表達轉(zhuǎn)基因(7天)。(2)由于轉(zhuǎn)基因丟失，有必要在首次注射載體后14-21天期間，以不同血清型AAV載體(如AAV5)經(jīng)不同給藥途徑(如i.p.)進行加強注射，以期維持轉(zhuǎn)基因表達水平。
　　 結論：
　　 通過在小鼠及NHP動物模型中的全面系統(tǒng)評估，與其它新型AAV相比，AAV8載體具有極為突出的肝臟轉(zhuǎn)基因效率和安全性。在充分結合scAAV載體起效快、轉(zhuǎn)導效率高等優(yōu)點的前提下，scAAV8載體在Spf-ash小鼠OT