維生素c的生產(chǎn)

1、學(xué)習(xí)目標(biāo),了解維生素C的性質(zhì)及生物合成工藝原理；熟悉萊氏法生產(chǎn)維生素C的生產(chǎn)工藝；掌握兩步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C的生產(chǎn)工藝。,第一節(jié) 概述,應(yīng)用:維生素C（Vitamin C，VC）又名抗壞血酸，化學(xué)名稱為L(zhǎng)-2,3,5,6-四羥基-2-己烯酸-γ-內(nèi)酯。是人體不可缺少的要素，維生素C是細(xì)胞氧化-還原反應(yīng)中的催化劑，參與機(jī)體新陳代謝，增加機(jī)體對(duì)感染的抵抗力。其結(jié)構(gòu)式為：,性質(zhì)：維生素C是一種白色或略帶淡黃色的結(jié)晶或粉末，無(wú)臭、

2、味酸、遇光色漸變深，水溶液顯酸性。易溶于水，略溶于乙醇，不溶于乙醚、氯仿和石油醚等有機(jī)溶劑。水溶液在pH為5~6之間穩(wěn)定，若pH值過高或過低，并在空氣，光線和溫度的影響下，可促使內(nèi)酯環(huán)水解，并可進(jìn)一步發(fā)生脫羧反應(yīng)而成糠醛，聚合易變色。,第二節(jié) 合成原理,萊氏法 德國(guó)的萊奇登（Reichstein）等人以D-山梨醇為原料，經(jīng)黑醋菌（Acetobacter Melanogenum）一步發(fā)酵得L-山梨糖，將此糖在酸性條件下，經(jīng)

3、丙酮酮醇縮合，得雙丙酮糖，再經(jīng)次氯酸鈉（或高錳酸鉀）氧化得雙丙酮-2-酮-L-古龍酸，再將后者水解去丙酮后經(jīng)鹽酸轉(zhuǎn)化得維生素C。 這種方法用強(qiáng)氧化劑將L-山梨糖在4位的仲醇基氧化生成維C的重要前體——2-酮基-L古龍酸（2-Keto-L-gulonic acid，簡(jiǎn)稱2-KGA）。為了保護(hù)山梨糖C6位伯醇基不被氧化，就須在酸性條件下先用丙酮處理L-山梨糖，形成雙丙酮衍生物后再進(jìn)行氧化；氧化后還必須水解生成2-酮基-L-古龍

4、酸 （不穩(wěn)定，難分離出），再經(jīng)轉(zhuǎn)化而得維C。,,,兩步發(fā)酵法 以氧化葡萄糖酸桿(Glnanobacter oxydans)為主要產(chǎn)酸菌，以條紋假單孢桿菌（Pseudomonas striata）為伴生菌的自然組合菌株，將L-山梨糖繼續(xù)氧化成維C的前體——2-酮基-L-古龍酸，最后經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化制備成維C。,第三節(jié) 生產(chǎn)工藝過程,萊氏法維生素C生產(chǎn)工藝過程,1．D-山梨醇的制備 山梨醇是葡萄糖在氫作還原劑，鎳作催化

5、劑的條件下，將葡萄糖醛基還原成醇羥基而制得的。,,工藝過程 將水加熱至70~75℃，在不斷攪拌下逐漸加入葡萄糖至全溶，制成50%葡萄糖水溶液，再加入活性炭于75℃，攪拌10min，濾去炭渣，然后用石灰乳液調(diào)節(jié)濾液pH8.4，備用。當(dāng)氫化釜內(nèi)氫氣純度≥99.3%，壓強(qiáng)>0.04Mpa時(shí)可加入葡萄糖濾液，同時(shí)在觸媒槽中添加活性鎳，利用糖液沖入釜內(nèi)，以堿液調(diào)節(jié)pH為8.2~8.4，然后通蒸汽并攪拌。當(dāng)溫度達(dá)到120~135℃時(shí)關(guān)蒸汽

6、，并控制釜溫在150~155℃，壓強(qiáng)在3.8~4.0MPa。取樣化驗(yàn)合格后，在0.2~0.3MPa壓強(qiáng)下壓料至沉淀缸靜置沉淀，過濾除去催化劑，濾液經(jīng)離子交換樹脂交換，活性炭處理，即得D-山梨醇。,,2．L-山梨糖的制備 經(jīng)過黑醋菌的生物氧化，可選擇性地使D-山梨醇的2位羥基氧化成酮基，即得L-山梨糖。,工藝過程：①菌種部分 將黑醋菌保存于斜面培養(yǎng)基中，每月傳代一次，保存于0~5℃冰箱內(nèi)。以后菌種從斜面培養(yǎng)基移入三角瓶種液

7、培養(yǎng)基中，在30~33℃振蕩培養(yǎng)48h，合并入血清瓶?jī)?nèi)，糖量在100mg/ml以上，鏡檢菌體正常，無(wú)雜菌，可接入生產(chǎn)。,,②發(fā)酵部分 種子培養(yǎng)分為一、二級(jí)種子罐培養(yǎng)，都以質(zhì)量濃度為16%~20%的D-山梨醇投料，并以玉米漿、酵母膏、泡敵、碳酸鈣、復(fù)合維生素B、磷酸鹽、硫酸鹽等為培養(yǎng)基。 30~340C ，通入無(wú)菌空氣（1VVM），并維持罐壓0.03~0.05MPa進(jìn)行一、二級(jí)種子培養(yǎng)。當(dāng)一級(jí)種子罐產(chǎn)糖量大于50mg/ml（發(fā)酵率達(dá)40%

8、以上），二級(jí)種子罐產(chǎn)糖量大于70mg/ml（發(fā)酵率在50%以上），菌體正常，即可移種。,,發(fā)酵罐部分是以20%左右D-山梨醇為投料濃度，另以玉米漿、尿素為培養(yǎng)基，在pH5.4~5.6，滅菌消毒冷卻后，按接種量為10%接入二級(jí)種子培養(yǎng)液。在31~34℃，通入無(wú)菌空氣（0.7VVM），維持罐壓0.03~0.05Mpa等條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)發(fā)酵率在95%以上，溫度略高（31~33℃）、pH在7.2左右，糖量不再上升時(shí)即為發(fā)酵的終點(diǎn)。③后處理部

9、分 將發(fā)酵液過濾除去菌體，然后控制真空度在0.05MPa以上，溫度在60℃以下，將濾液減壓濃縮結(jié)晶即得L-山梨糖。,3．2,3,4,6-雙丙酮基-L-山梨糖（雙丙酮糖）的制備 山梨糖（酮式）經(jīng)過互變異構(gòu)轉(zhuǎn)變成環(huán)式山梨糖，再與兩分子丙酮反應(yīng)，將其結(jié)構(gòu)中2,3-位羥基及4,6-位羥基保護(hù)起來，生成2,3,4,6-雙丙酮基-L-山梨糖。,,工藝過程 生產(chǎn)中的配料比為L(zhǎng)-山梨糖：丙酮：發(fā)煙硫酸：氫氧化鈉：苯=1:9:0.4:0.

10、6:6（摩爾比）。將丙酮、發(fā)煙硫酸在5℃以下壓至溶糖罐內(nèi)，加入山梨糖，在15~20℃下溶糖6h后再降溫至-8℃，保持6~7h得酮化液。然后在溫度不超過25℃時(shí)酮化液中加入18%~22%氫氧化鈉溶液中，調(diào)節(jié)pH至8.0~8.5。下層硫酸鈉用丙酮洗滌，回收單丙酮糖；上層清液蒸餾至100℃后，減壓蒸餾至約90℃為終點(diǎn)，再用苯提取蒸餾后的剩余溶液，然后減壓蒸餾苯液得丙酮糖。,,,4．2,3,4,6-雙丙酮基-L-2-酮基-古龍酸（雙丙酮古龍酸）

11、的制備 用次氯酸鈉將2,3,4,6-雙丙酮基-L-山梨糖氧化成2,3,4,6-雙丙酮基-L-2-酮基古龍酸鈉，再用濃鹽酸酸化即得2,3,4,6-雙丙酮基-L-2-酮基-古龍酸。,,工藝過程①次氯酸鈉的制造 次氯酸鈉性質(zhì)不穩(wěn)定，久置易分解失去氧化性，所以需新鮮配制。在35℃下將14.5%~15.5%氫氧化溶液攪拌通入液氯，以有效氯濃度9.5%~9.7%，余堿濃度2.8~3.2%為終點(diǎn)。②雙丙酮糖的氧化 配料比為雙丙酮糖：

12、次氯酸鈉：硫酸鎳=1：10：0.04(摩爾比)。將次氯酸鈉、雙丙酮糖及硫酸鎳在溫度40℃保溫?cái)嚢?0min，然后靜止片刻，抽濾。濾液冷至0~5℃時(shí)，用鹽酸中和，分三段進(jìn)行：pH7，pH3，pH1.5。甩濾，冷水洗，再甩濾1h，即得2，3，4，6-雙丙酮基-L-2-酮基-古龍酸結(jié)晶。,,5．粗品Vc的制備 先將雙丙酮古龍酸水解脫去保護(hù)基丙酮，再進(jìn)行內(nèi)酯化，最后進(jìn)行烯醇化即得粗Vc。,,工藝過程 配料比為雙丙酮古龍酸（折純）

13、：精制鹽酸（38%）：乙醇=1：0.27：0.31。生產(chǎn)中先將部分雙丙酮古龍酸加入轉(zhuǎn)化罐，攪拌加入鹽酸，再加入余下的雙丙酮古龍酸，蓋好罐蓋。等反應(yīng)罐夾層滿水后，打開蒸汽閥門，緩慢升溫至37℃左右關(guān)蒸汽，自然升溫至52~54℃，保溫5~7h。反應(yīng)到達(dá)高潮時(shí)，結(jié)晶析出，要嚴(yán)格控制溫度低于60℃，高潮期過后，維持50~52℃至總保溫時(shí)間20h。接著開冷卻水降溫1h，加入適當(dāng)體積的乙醇，冷卻至-2℃，放料，甩濾0.5h，再用乙醇洗滌，甩濾3~

14、3.5h，經(jīng)干燥得粗Vc。,,6．粗品Vc的精制 配料比為粗Vc（析純）：蒸餾水：活性炭：乙醇=1：1.1：0.06：0.6（質(zhì)量比）。將粗品Vc真空干燥（0.9MPa，45℃，20~30min），除去揮發(fā)性雜質(zhì)（鹽酸、丙酮），加蒸餾水?dāng)嚢瑁齎c溶解后，加入活性炭，攪拌5~10min，壓濾，濾液至結(jié)晶罐，加入50L乙醇，降溫后加晶種使結(jié)晶。將晶體離心甩濾，再加乙醇洗滌，甩濾，將甩干品真空干燥（0.9MPa，43~45

15、℃，1.5h）即得精制Vc。,,兩步發(fā)酵法維生素C生產(chǎn)工藝,1．D-山梨醇的制備（見萊氏法）2．L-山梨糖的制備（1）菌種部分 黑醋菌部分同萊氏法（2）發(fā)酵液制備部分 基本同萊氏法，只是D-山梨醇的投料濃度適當(dāng)?shù)托?0%左右。（3）發(fā)酵液處理部分 發(fā)酵終點(diǎn)后對(duì)生成的L-山梨糖（醪液）應(yīng)立即于80℃加熱10min，殺死第一步發(fā)酵液微生物后，冷卻至30℃，再開始進(jìn)行第二步的混合菌株發(fā)酵。,,3．2-酮基-L-古龍酸的制備,（1）菌

16、種部分 將保存于冷凍管的假單孢桿菌和氧化葡萄糖酸桿菌菌種活化，分離及混合培養(yǎng)后移入三角瓶種液培養(yǎng)基中，在29~33℃振蕩培養(yǎng)24h，產(chǎn)酸量在6~9mg/ml，pH值降至7以下，菌形正常無(wú)雜菌，再移入血清瓶中，即可接入生產(chǎn)。（2）發(fā)酵液制備部分 先在一級(jí)種子培養(yǎng)罐內(nèi)加入經(jīng)過滅菌后的輔料（玉米漿、尿素及無(wú)機(jī)鹽）和醪液（折純含山梨糖1%），控制溫度為29~30℃，發(fā)酵初期溫度較低，通入無(wú)菌空氣維持罐壓為0.05MPa，pH6.7~7.0，至

17、產(chǎn)酸量達(dá)合格濃度，且不再增加時(shí)，接入二級(jí)種子罐培養(yǎng)，條件控制同前。作為伴生菌的芽孢桿菌開始形成芽孢時(shí)，產(chǎn)酸菌株開始產(chǎn)生2-酮基-L-古龍酸，直到完全形成芽孢和出現(xiàn)游離芽孢時(shí)，產(chǎn)酸量達(dá)高峰（5mg/ml以上）為二級(jí)種子培養(yǎng)終點(diǎn)。,,供發(fā)酵罐用的培養(yǎng)基經(jīng)滅菌冷卻后，加入至山梨糖的發(fā)酵液內(nèi)，接入第二步發(fā)酵菌種的二級(jí)種子培養(yǎng)液，在溫度30℃，通入無(wú)菌空氣下進(jìn)行發(fā)酵，為保證產(chǎn)酸正常進(jìn)行，往往定期滴加滅菌的碳酸鈉溶液調(diào)pH值，使保持7.0左右。當(dāng)溫

18、度略高（31~33℃），pH 在7.2左右、二次檢測(cè)酸量不再增加，殘?zhí)橇?.5mg/ml以下，即為發(fā)酵終點(diǎn)，得含古龍酸鈉的發(fā)酵液。 整個(gè)發(fā)酵過程可分為產(chǎn)酸前期、產(chǎn)酸中期和產(chǎn)酸后期。影響發(fā)酵產(chǎn)率的因素主要有山梨糖初始濃度、溶氧濃度、 pH值等。,,（3）2-酮基-L-古龍酸的分離 發(fā)酵液中除了含有一定量的2-酮基-L-古龍酸鈉及2-酮基-L-古龍酸外，還含有大量的菌體蛋白。要將2-酮基-L-古龍酸鈉從發(fā)酵液中分離提取

19、出來，必須先除去菌體蛋白。除去菌體蛋白的發(fā)酵液中含2-酮基-L-古龍酸鈉及2-酮基-L-古龍酸，由于2-酮基-L-古龍酸鈉（能解離為陰、陽(yáng)離子），用732陽(yáng)離子交換樹脂進(jìn)行交換可去掉其中Na+而得2-酮基-L-古龍酸稀液。高溫下2-酮基-L-古龍酸不穩(wěn)定，所以為了濃縮古龍酸溶液使其達(dá)到一定濃度，可采用減壓濃縮的方法。由于低溫下2-酮基-L-古龍酸溶解度較小，所以可經(jīng)冷卻結(jié)晶得2-酮基-L-古龍酸晶體，從而實(shí)現(xiàn)了從發(fā)酵液中提取分離2-酮基

20、-L-古龍酸的操作過程。,2-酮基-L-古龍酸的分離工藝及操作,（1）離子交換 ①將發(fā)酵液冷卻后用鹽酸酸化，調(diào)至菌體蛋白等電點(diǎn)，使菌體蛋白沉淀。靜置數(shù)小時(shí)后去掉菌體蛋白，將酸化上清液以(2～3)m3/h的流速壓入一次陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行離子交換?；?qū)l(fā)酵液加入至循環(huán)槽，經(jīng)冷卻調(diào)節(jié)pH值后，用泵打入微濾膜、超濾膜過濾器內(nèi)除去菌體及蛋白類物質(zhì)后，將濾液壓入陽(yáng)離子交換柱內(nèi)進(jìn)行離子交換。當(dāng)回流到pH3.5時(shí)，開始收集交換液，控制流出液的pH值，

21、以防樹脂飽和，發(fā)酵液交換完后，用純水洗柱，至流出液古龍酸含量低于1mg/ml以下為止。當(dāng)流出液達(dá)到一定pH值時(shí)，則更換樹脂進(jìn)行交換，原樹脂進(jìn)行再生處理。,,,② 將經(jīng)過一次交換后的流出液和洗液合并，在加熱罐內(nèi)調(diào)pH至蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，然后加熱至70℃左右，加0.3%左右的活性炭，升溫至90℃～95℃后再保溫(10～15)min，使菌體蛋白凝結(jié)。停攪拌，快速冷卻，高速離心過濾得清液。 ③將酸性上清液打入二次交換柱進(jìn)行離子交換，至流出液

22、的pH1.5時(shí)，開始收集交換液，控制流出液pH1.5～1.7，交換完畢，洗柱至流出液古龍酸含量在1mg/ml以下為止。若pH>1.7時(shí)，需更換交換柱。 （2）減壓濃縮結(jié)晶 先將二次交換液進(jìn)行一級(jí)真空濃縮，溫度45℃，至濃縮液的相對(duì)密度達(dá)1.2左右，即可出料。接著，又在同樣條件下進(jìn)行二級(jí)濃縮，然后加入少量乙醇，冷卻結(jié)晶，甩濾并用冰乙醇洗滌，得2-酮基-L-古龍酸。 如果以后工序使用堿轉(zhuǎn)化，則需將2-酮基-L-古龍酸進(jìn)