管碟法測(cè)定抗生素效價(jià)詳解

1、抗生素微生物測(cè)定法,一、概述,1.抗生素的概念及抗生素的生物檢定 抗生素是由微生物所產(chǎn)生的極微量便具有選擇性地殺死或抑制其他病原微生物生長(zhǎng)的一類(lèi)天然有機(jī)化合物。 抗生素的生物檢定是以抗生素對(duì)微生物的抗菌效力作為效價(jià)的衡量標(biāo)準(zhǔn)。,2.抗生素的效價(jià)和單位 抗生素的含量用效價(jià)和單位表示。該詞有時(shí)不加區(qū)別統(tǒng)稱(chēng)為效價(jià)單位。 效價(jià)（ｐotency），指檢品的實(shí)際

2、單位數(shù)與其標(biāo)示量的比值。常表示為效價(jià)的百分?jǐn)?shù)。 單位（unit,u）單位是衡量抗生素有效成分的具體尺度。,（１）重量單位 以抗生素的生物活性部分重量作單位１微克（ｕｇ）＝１單位，１毫克＝１０００單位。（２）類(lèi)似重量單位 以特定的純粹抗生素鹽類(lèi)的重量作為１單位。如純粹金霉素鹽酸鹽及四環(huán)素鹽酸鹽（包括無(wú)生物活性的鹽酸根在內(nèi)）１微克（ｕｇ）＝１單位，１毫克＝１０００個(gè)單位。這是根據(jù)國(guó)際使用習(xí)慣而來(lái)的。（３）

3、質(zhì)量折算單位 以特定的純抗生素鹽的質(zhì)量為單位而加以折算。青霉素0.6ug為1單位（４）特定單位 以特定的抗生素標(biāo)準(zhǔn)品的某一質(zhì)量定為一單位。,管碟法濁度法,抗生素微生物檢定法,1、管碟法：是利用抗生素在攤布特定試驗(yàn)菌的固體培養(yǎng)基內(nèi)呈球面形擴(kuò)散，形成含有一定濃度抗生素球形區(qū)，抑制了試驗(yàn)菌的繁殖而呈現(xiàn)出的透明抑菌圈。此法系根據(jù)抗生素在一定濃度范圍內(nèi)，對(duì)數(shù)劑量與抑菌圈面積呈線(xiàn)性關(guān)系，通過(guò)比較 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品產(chǎn)生抑菌 圈的大小

4、，計(jì)算出供試品 的效價(jià)。,,2、濁度法系利用抗生素在液體培養(yǎng)基中對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的抑制作用，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)后細(xì)菌濁度值的大小，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)抑制的程度，以測(cè)定供試品效價(jià)的一種方法。,管碟法測(cè)定抗生素效價(jià)原理和方法,一、 原理 在一定的抗生素濃度范圍內(nèi)，對(duì)數(shù)劑量(濃度)與抑菌圈的表面積或直徑成正比，可以得出一條曲線(xiàn)。 抗生素濃度換算成對(duì)數(shù)，則抑菌圈直徑與抗生素對(duì)數(shù)成直線(xiàn)關(guān)系,2.原理－抑

5、菌圈的形成,兩種互動(dòng)作用：一種是抗生素溶液向培養(yǎng)基內(nèi)呈球面狀擴(kuò)散作用；另一種是試驗(yàn)菌的生長(zhǎng)作用。當(dāng)培養(yǎng)到一定時(shí)間，瓊脂培養(yǎng)基中的兩種互動(dòng)作用達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，瓊脂培養(yǎng)基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素濃度高于抑菌濃度，試驗(yàn)菌生長(zhǎng)受到抑制，此處瓊脂培養(yǎng)基成透明狀；在抑菌圈邊緣抗生素濃度恰好等于抗生素最低抑菌濃度。,一、試驗(yàn)前準(zhǔn)備,雙碟的挑選,內(nèi)徑約90mm，硬質(zhì)玻璃或塑料培養(yǎng)平皿，水平透明，無(wú)色斑氣泡,物品的清洗、滅菌,培養(yǎng)皿

6、、鋼管、刻度吸管清洗后160℃干熱滅菌2小時(shí)或121℃高壓蒸汽滅菌30min，放置室溫備用；陶瓷瓦蓋要定期清洗干燥。,牛津杯的挑選,內(nèi)徑（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm，外徑（7.8±0.1）mm，重量差異不超過(guò)±0.01g，光潔平坦,緩沖液的制備,磷酸鹽緩沖液（pH6.0） 取磷酸氫二鉀2g與磷酸二氫鉀8g，加水使成1000ml，濾過(guò)。磷酸鹽緩沖液（pH7.0） 取磷酸氫二鈉

7、（Na2HPO4*12H2O）9.39g與磷酸二氫鉀3.5g，加水使成1000ml，濾過(guò)。磷酸鹽緩沖液（pH7.8） 取磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g，加水使成1000ml，濾過(guò)。,基本要點(diǎn) ： ① 高劑量抗生素溶液所形成的抑菌圈直徑在18～22mm； ② 高、低劑量所形成的抑菌圈之差最好大于2 mm，有些抗生素的差數(shù)可較?。?③ 高、低劑量之比一般用2:1，當(dāng)高、低劑量所致的抑菌圈差別較小時(shí)，可用高低劑量之比為4:1的比

8、率。,,儀器與用具1 . 操作室2. 雙碟 3. 陶瓦蓋　　4. 鋼管 5. 鋼管放置器6. 恒溫培養(yǎng)箱 7. 滅菌刻度吸管 8. 玻璃容器 9. 稱(chēng)量瓶 10.毛細(xì)滴管或可調(diào)式移液器（1～1000μl) 　11.天平12.抑菌圈(直徑)測(cè)量?jī)x。13.超凈工作臺(tái)　用于菌種的接種或傳代。超凈工作臺(tái)須置潔凈工作室或半無(wú)菌室內(nèi)。,檢定菌的來(lái)源：檢定菌種由中監(jiān)所所提供

9、的冷凍干燥品。    檢定菌的傳代和接種：  芽胞桿菌3～6個(gè)月（其他細(xì)菌每個(gè)月）用普通瓊脂斜面?zhèn)鞔?次，將新傳代的培養(yǎng)物代替原有的菌種，作為工作用（陽(yáng)性對(duì)照）菌種。傳代和接種在菌種接種室內(nèi)按無(wú)菌操作要求進(jìn)行。,冷凍菌種安瓶的接種。 用75%酒精棉擦凈菌種安瓿的外壁，稍干。 點(diǎn)燃酒精燈，將安瓿的封口，一端在火焰上燒灼紅熱用毛細(xì)管吸取滅菌水少許在灼熱處，使其驟冷而炸裂，另

10、取1支滅菌毛細(xì)滴管，在火焰旁吸取少量滅菌水，加至菌種管底部，將凍干菌塊攪動(dòng)促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，分別接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，將營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面瓊脂斜面于37℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)。,管碟法的操作步驟,預(yù)試驗(yàn)→試驗(yàn)準(zhǔn)備→ 雙碟底層的制備→ 供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備→菌層的制備→滴加抗生素溶液→雙碟的培養(yǎng)→ 抑菌圈的測(cè)量→結(jié)果的可靠性檢驗(yàn)及效價(jià)測(cè)定,預(yù)試驗(yàn)： 確定最佳的試驗(yàn)條件：調(diào)整試驗(yàn)菌的濃度、使用量、抗生素終濃度、培養(yǎng)

11、基等，使抑菌圈的大小符合規(guī)定：高劑量濃度溶液所致的抑菌圈直徑在18～22mm。高劑量與低劑量的抑菌圈直徑之差最好不小于2mm。高低劑量之比為2:1（如高、低劑量所致的抑菌圈差別較小時(shí)，可用4:1的劑量比率）。,,試驗(yàn)準(zhǔn)備： 雙碟、鋼管、毛細(xì)滴管、吸管的清洗及滅菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培養(yǎng)基、緩沖液的準(zhǔn)備、半無(wú)菌間的紫外消毒等。,,供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備： 估計(jì)供試品的效價(jià)，根據(jù)試驗(yàn)要求設(shè)計(jì)供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋步

12、驟，平行制備供試品、標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)劑量的溶液。,,,1. 稱(chēng)量 稱(chēng)量前，將標(biāo)準(zhǔn)品從冰箱取出，使與溫室平衡；供試品應(yīng)放于干燥器內(nèi)至少30min方可稱(chēng)取。供試品與標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用同一天平；吸濕性較強(qiáng)的抗生素，在稱(chēng)量前1～2ｈ更換天平內(nèi)干燥劑。標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的稱(chēng)量最好一次取樣稱(chēng)取，不得將已取出的標(biāo)準(zhǔn)品或供試品倒回原容器內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量不可少于20mg，取樣后立即將稱(chēng)量瓶及被稱(chēng)物蓋好，以免吸水。樣品的稱(chēng)樣量最好不少于50mg。,2. 稀釋 稀釋操作

13、應(yīng)遵照容量分析的操作規(guī)程。　從冰箱中取出的標(biāo)準(zhǔn)溶液，必須先在室溫放置，使其溫度達(dá)到室溫后，方可量取。標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液的稀釋?xiě)?yīng)采用容量瓶，每步稀釋?zhuān)恿坎坏蒙儆?ml為宜，稀釋步驟一般不超過(guò)3步。舉例：取濃溶液1000u/ml。第一步取5ml（1000U/ml）→50ml容量瓶→100U/ml；第二步取5ml（100u/ml）→50ml容量瓶→10U/ml（H）；取5ml（100U/ml）→100ml容量瓶→5U/ml（L）?！∶?/p>

14、次吸取溶液用刻度吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管2～3次，吸取樣品溶液后，用濾紙將外壁多余液體擦去，從起始刻度開(kāi)始放溶液。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與供試品用的緩沖液應(yīng)同一批和同瓶，以免因pH或濃度不同影響測(cè)定結(jié)果。稀釋時(shí)，每次加液至容量瓶近刻度前，稍放置片刻，待瓶壁的液體完全流下，再準(zhǔn)確補(bǔ)加至刻度。,3． 雙碟的制備 在半無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行，應(yīng)注意微生物及抗生素的污染，培養(yǎng)基應(yīng)在水浴中或微波爐中融化，避免直火加熱?！　〉讓樱河脺缇罂谖埽?0ml

15、）或其他滅菌分裝器，吸取已融化的培養(yǎng)基20ml注入雙碟內(nèi)，等凝固后更換干燥的陶瓦蓋，放于35～37℃培養(yǎng)箱中保溫，使易于攤布菌層。　　菌層:取出試驗(yàn)用菌懸液，按已試驗(yàn)妥的菌量[按(2.2)法標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18～22mm；用滅菌吸管吸取菌懸液加入已融化并保溫在水中(一般細(xì)菌48～50℃，芽孢可至60℃)的培養(yǎng)基內(nèi)，搖勻作為菌層用。用滅菌大口10ml吸管或其他分裝器，吸取菌層培養(yǎng)基5ml，使均勻攤布在底層培養(yǎng)基上，置

16、水平臺(tái)上并用陶瓦圓蓋覆蓋，放置20 ～ 30min，待凝固，備用。,4．放置鋼管 用鋼管放置器，將干熱滅菌的鑷子或適宜方法將鋼管裝于玻璃管中，放于鋼管放置器上，將雙碟打開(kāi)，放入雙碟臺(tái)上，托起雙碟臺(tái)，使鋼管平穩(wěn)落在培養(yǎng)基上，注意使各個(gè)鋼管下落的高度基本一致，鋼管放妥后，雙碟靜置5～10 min,使鋼管在瓊脂內(nèi)稍下穩(wěn)定后，再開(kāi)始加抗生素溶液?！?．滴加抗生素溶液　　每批供試品取6~10個(gè)雙碟，滴加溶液可調(diào)式移液器，在滴加之前須用滴加液

17、洗2~3次。滴加溶液的順序:SH→TH→SL→TL。滴加溶液至鋼管口平滿(mǎn)，注意滴加溶液間隔不可過(guò)長(zhǎng)，因溶液的擴(kuò)散時(shí)間不同影響測(cè)定結(jié)果。,二劑量法（2 ? 2法）：用標(biāo)準(zhǔn)品、供試品各兩個(gè)劑量，根據(jù)量反應(yīng)平行線(xiàn)原理，在相同試驗(yàn)條件下，比較標(biāo)準(zhǔn)品和供試品二者對(duì)微生物產(chǎn)生的效力。二劑量法用于抗生素藥品效價(jià)的常規(guī)測(cè)定；,雙碟底層的制備： 每只雙碟加底層培養(yǎng)基約20ml，待培養(yǎng)基凝固，待用。,,菌層的制備： 菌層培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中添

18、加一定量的菌懸液，振搖混勻。注意菌層培養(yǎng)基溫度；根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定加入菌層培養(yǎng)基的菌液量。 每只雙碟加入5ml菌層培養(yǎng)基。 注意制備菌層的速度和平整度。,,待菌層凝固干燥15min左右，放置鋼管，待鋼管自然沉降15min后，按SH→TH→SL→TL順序滴加藥液。,滴加抗生素溶液：,,,注意標(biāo)準(zhǔn)品、供試品高、低劑量溶液滴加順序，保證滴加速度和加量的均勻一致。每組雙碟至少為8個(gè)，一般為10個(gè)。,在每個(gè)雙碟的4個(gè)鋼管中，對(duì)角的兩個(gè)

19、鋼管分別滴加高濃度和低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其余兩個(gè)對(duì)角位置的鋼管分別滴加相應(yīng)的高、低濃度的供試品溶液。,按SH→TH→SL→TL順序，分別滴加標(biāo)準(zhǔn)品和供試品高、低劑量溶液。,雙碟的培養(yǎng)： 根據(jù)培養(yǎng)溫度的要求在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中水平疊放的雙碟數(shù)以不超過(guò)三層為宜。,,抑菌圈的測(cè)量： 將培養(yǎng)好的雙碟取出，打開(kāi)陶瓦蓋，將鋼管倒入1：1000新潔爾滅溶液或其他消毒液內(nèi)浸泡，檢查抑菌圈是否圓整，如有破圈或不圓整圈應(yīng)將碟棄去，切

20、忌主觀挑選抑菌圈和雙碟，是結(jié)果造成偏離。 抑菌圈測(cè)量?jī)x的使用：每組試驗(yàn)雙碟應(yīng)在相同的測(cè)量參數(shù)下進(jìn)行測(cè)量。,,結(jié)果的可靠性檢驗(yàn)及效價(jià)測(cè)定： 抑菌圈測(cè)量?jī)x提供計(jì)算結(jié)果或手工計(jì)算結(jié)果。,記錄與計(jì)算　1. 試驗(yàn)記錄 應(yīng)包括抗生素的品種、劑型、標(biāo)示量、生產(chǎn)廠、批號(hào)、檢查目的、檢驗(yàn)依據(jù)、檢驗(yàn)日期、溫度、濕度，標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的稱(chēng)量、稀釋步驟與核對(duì)人，抑菌圈測(cè)量結(jié)果。當(dāng)用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑時(shí)，應(yīng)將測(cè)試數(shù)據(jù)以框圖方式順雙碟數(shù)記錄

21、。當(dāng)用測(cè)量?jī)x測(cè)量面積或直徑時(shí)，應(yīng)將電腦測(cè)試、計(jì)算、統(tǒng)計(jì)分析的打印紙貼附于記錄中?！?. 計(jì)算注意事項(xiàng)：a、濃度比不等于1.000時(shí)，如標(biāo)準(zhǔn)品溶液（S）d的濃度為1005u/ml,而供試品溶液(T)的濃度995u/ml，D=S/T=1.0101；也可將D值設(shè)為1.000，而估計(jì)效價(jià)設(shè)為101.01%b、所測(cè)定的實(shí)際效價(jià)應(yīng)在D值與估計(jì)效價(jià)乘積的90%和110%范圍內(nèi)，超出就應(yīng)重新估計(jì)效價(jià)。如估計(jì)效價(jià)為100%，D=1.000，而測(cè)得的效

22、價(jià)為115%，按110%重估效價(jià)再進(jìn)行試驗(yàn)。C、原料及不合格供試品，進(jìn)行平行試驗(yàn)，配置兩份標(biāo)準(zhǔn)品和兩份供試品，一份標(biāo)準(zhǔn)品與一份供試品為一組滴樣,結(jié)果判斷　1.　可靠性測(cè)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為可靠，方可進(jìn)行效價(jià)和可信限率計(jì)算。　2.可信限率　考核實(shí)驗(yàn)的精密度，除藥典各論另有規(guī)定外，本法的可信限率不得超過(guò)5%。上述各項(xiàng)規(guī)定都能符合者，試驗(yàn)結(jié)果成立?！?. 實(shí)驗(yàn)計(jì)算　所得效價(jià)低于估計(jì)效價(jià)的90%或高于估計(jì)效價(jià)的110%，則檢驗(yàn)結(jié)果僅作為初試，應(yīng)調(diào)

23、整供試品估計(jì)效價(jià)，予以重試。　4. 效價(jià)測(cè)定　一般需雙份樣品，平行實(shí)驗(yàn)以便核對(duì)。對(duì)不符合規(guī)定的樣品應(yīng)至少有2次符合規(guī)定的結(jié)果，才能發(fā)出報(bào)告。,克服常見(jiàn)的一些影響因素,1. 實(shí)驗(yàn)器材的準(zhǔn)備 1.1 實(shí)驗(yàn)器材的選擇試驗(yàn)應(yīng)該選擇底面平整的玻璃雙碟，避免底面的凹凸影響瓊脂層的厚度?？蓪㈦p碟放置在水平臺(tái)上，下墊一層白紙，加入3mL水，再滴加藍(lán)墨水，根據(jù)藍(lán)色是否深淺一致來(lái)判斷雙碟底面平整程度。小鋼管則應(yīng)該選擇加工精細(xì)的

24、同一批產(chǎn)品，這樣才能保證管壁厚薄與重量均勻一致，使得小鋼管在培養(yǎng)基中下陷相同的深度，抗生素溶液擴(kuò)散均勻有可比性。如果小鋼管兩端不夠平，就應(yīng)予剔除，否則會(huì)使抗生素溶液漏出，破壞均勻擴(kuò)散現(xiàn)象,,1.2 實(shí)驗(yàn)器材的清洗 抗生素試驗(yàn)中，玻璃雙碟、小鋼管往往會(huì)連續(xù)使用。由于清洗方面的原因，它們還是容易殘留上次試驗(yàn)中的抗生素（慶大霉素、爭(zhēng)光霉素、鏈霉素等）或者被清洗用的殺菌劑（如新潔而滅、洗潔精等）污染，以至于在下次試驗(yàn)中造成抑菌圈不正常的現(xiàn)象。

25、因此，在清洗時(shí)要尤為注意多用流水沖洗。160℃干熱滅菌2h后備用。,2. 配制試驗(yàn)所需的樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、緩沖液與培養(yǎng)基 2.1 樣品與標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品從冰箱取后，使與室溫平衡。稱(chēng)量最好為一次取樣稱(chēng)量，動(dòng)作迅速，不得反復(fù)稱(chēng)取，取樣后立即將稱(chēng)量瓶瓶蓋蓋好，以免吸水。標(biāo)準(zhǔn)品的稱(chēng)量最好用1/100,000克的分析天平，樣品稱(chēng)量不得低于1/10,000克的分析天平。天平中的干燥劑應(yīng)保持經(jīng)常注意更換。稱(chēng)量結(jié)束后，加入磷酸緩沖液，

26、定容至刻度，過(guò)濾并稀釋。稀釋時(shí)，都應(yīng)采用容量瓶，每一步稀釋取樣量不得少于2mL。用刻度吸管吸取溶液前，要用待稀釋液沖洗吸管2～3次，吸取溶液后，要用濾紙把刻度吸管外壁多余液體擦去，再?gòu)钠鹗伎潭乳_(kāi)始放溶液。在稱(chēng)量抗生素樣品過(guò)程中，操作者的工作服上有可能會(huì)沾染抗生素粉末，在配培養(yǎng)基、加底層培養(yǎng)基、加菌層培養(yǎng)基或滴加抗生素溶液時(shí)，會(huì)隨衣袖的抖動(dòng)落入培養(yǎng)基，造成破圈或者無(wú)抑菌圈。所以配制抗生素溶液應(yīng)單獨(dú)使用一套工作服。,2.2 培養(yǎng)基與緩沖液的

27、配制 配制培養(yǎng)基與緩沖液時(shí)要按照配比用量，配制后調(diào)節(jié)其pH值。因?yàn)樵趐H值、鹽濃度的影響下，即使瓊脂培養(yǎng)基上的兩個(gè)相鄰的小管距離足夠，還是可能會(huì)出現(xiàn)卵圓形抑菌圈。例如四環(huán)素易受pH值影響，鏈霉素易受鹽濃度影響。培養(yǎng)基可以購(gòu)買(mǎi)廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品，因?yàn)榇笈慨a(chǎn)品中的成分配比較穩(wěn)定，可比性較強(qiáng)。,,3. 加注培養(yǎng)基 3.1 加注底層培養(yǎng)基無(wú)菌室工作臺(tái)面可能因?yàn)槭褂脮r(shí)間已久，變得凹凸不平或者傾斜，會(huì)影響培養(yǎng)基菌層的厚度均勻性。菌層越薄，形成

28、的抑菌圈越大，會(huì)給試驗(yàn)造成很大的誤差。我們可以在桌面上放置一塊足夠大的玻璃平板，保證雙碟放置區(qū)域的平整。試驗(yàn)中加注的培養(yǎng)基如果溫度太低，就容易在內(nèi)部結(jié)塊，或者加注到雙碟之后不能及時(shí)鋪開(kāi)，使得培養(yǎng)基表面為非水平面，會(huì)給試驗(yàn)帶來(lái)誤差。加注60～65℃的培養(yǎng)基底層之后，不應(yīng)立即給雙碟加蓋。因?yàn)闇囟冗^(guò)高的培養(yǎng)基會(huì)形成大量的水蒸氣，在雙碟蓋上凝集并滴落在已經(jīng)凝固定的培養(yǎng)基底層上，會(huì)給培養(yǎng)基菌層的加注帶來(lái)影響。,,3.2 加注培養(yǎng)基菌層制備瓊脂培養(yǎng)

29、基菌層時(shí)，培養(yǎng)基溫度過(guò)高或者受熱時(shí)間太長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)菌死亡。當(dāng)菌種為非芽孢桿菌的時(shí)候，現(xiàn)象尤為明顯，甚至?xí)霈F(xiàn)無(wú)菌生長(zhǎng)。因此，培養(yǎng)基應(yīng)放在50℃水浴中保溫。當(dāng)加入試驗(yàn)菌種混勻后，應(yīng)盡快加注到底層培養(yǎng)基上。在試驗(yàn)的時(shí)候，如果從大瓶?jī)?nèi)用刻度吸管吸取帶菌培養(yǎng)基，吸管中培養(yǎng)基量少極易冷卻，加在底層培養(yǎng)基上就不易均勻鋪開(kāi)，導(dǎo)致菌層厚度不均，影響到抑菌圈的直徑。,,4. 放置小鋼管時(shí)，注意管與管之間不能太靠近，否則會(huì)引起相鄰的兩個(gè)抑菌圈之間的抗生素

30、擴(kuò)散區(qū)中的濃度增大，相互影響形成卵圓形或橢圓形抑菌圈。管與雙碟邊緣同樣也不能太靠近，因?yàn)橐好娼?rùn)作用，邊緣的瓊脂培養(yǎng)基菌層為非平面，會(huì)影響抑菌圈的形狀。小鋼管放置時(shí)，要小心地從同一高度垂直放在菌層培養(yǎng)基上，不得下陷，不得傾斜，不能用懸空往下掉的。放置之后，不能隨意移動(dòng)，要靜置5min，使之在瓊脂內(nèi)稍下沉降穩(wěn)定后，再開(kāi)始滴加抗生素溶液。,5. 滴加抗生素溶液滴加抗生素要按照SH→TH→SL→TL的順序滴加。滴加之前，滴管至少要用被滴液體沖

31、洗3次。在滴加抗生素到小鋼管的時(shí)候，由于毛細(xì)管內(nèi)抗生素溶液往往會(huì)有氣泡或者毛細(xì)管開(kāi)口端有液體殘留，繼續(xù)滴加容易造成氣泡膨脹破裂，使溶液濺落在瓊脂培養(yǎng)基表面造成破圈。因此一旦毛細(xì)管中出現(xiàn)氣泡或者殘留，就重新吸取抗生素溶液進(jìn)行滴加，毛細(xì)管口應(yīng)避免太細(xì)，滴加的時(shí)候離開(kāi)小鋼管口距離不要太高。滴加中若有濺出，可用濾紙片輕輕吸去，不致造成破圈。在滴加中還有可能出現(xiàn)抗生素溶液滴入小鋼管后，沒(méi)有與瓊脂培養(yǎng)基菌層接觸，有一段空氣被壓在溶液與培養(yǎng)基之間，這

32、樣是不會(huì)產(chǎn)生抑菌圈的。此時(shí)可以小心的用滴管吸出小鋼管內(nèi)的抗生素溶液，棄去。換滴管重新滴加?？股厝芤旱渭雍螅好鎽?yīng)該與小鋼管管口齊平，液面反光呈黑色。（抗生素液體加入量不能按滴，即使同一滴管，每滴的量也有差異。）如果抗生素溶液滴加過(guò)滿(mǎn)，可以用無(wú)菌濾紙片小心吸去多余部分。,6. 雙碟中菌株的培養(yǎng)滴加了抗生素溶液后的雙碟忌震動(dòng)，要輕拿輕放。雙碟在37℃下培養(yǎng)約16h至18h。在培養(yǎng)過(guò)程中，如果溫度不均勻，會(huì)造成同一雙碟上細(xì)菌生長(zhǎng)速率不等，使

33、抑菌圈變小或者不圓。所以把雙碟放入培養(yǎng)箱時(shí)，要與箱壁保持一定的距離，雙碟疊放也不能超過(guò)3個(gè)。培養(yǎng)中，箱門(mén)不得隨意開(kāi)啟，以免影響溫度。應(yīng)經(jīng)常注意溫度，防止意外過(guò)冷過(guò)熱。7. 抑菌圈測(cè)量 7.1 試驗(yàn)結(jié)果中抑菌圈直徑不應(yīng)該過(guò)大或者過(guò)小，在試驗(yàn)之前，可以先做一個(gè)關(guān)于用不同濃度菌液配制的瓊脂培養(yǎng)基菌層預(yù)試驗(yàn)，選擇抑菌圈直徑在18～22mm的菌液濃度。,,試驗(yàn)用濃度（菌液濃度約為106個(gè)/mL）。批量試驗(yàn)中后期，菌液保存的時(shí)間過(guò)久，菌株就會(huì)