梅毒實驗室檢測探討

1、梅毒實驗室檢測探討,左江成宜昌夷陵婦幼,梅毒螺旋體,梅毒是蒼白螺旋體（Treponema pallidum)(又名梅毒螺旋體）感染人體所引起的一種系統(tǒng)性、慢性經(jīng)典的性傳播疾病，可引起人體多系統(tǒng)多臟器的損害，產(chǎn)生多種多樣的臨床表現(xiàn)，導(dǎo)致組織破壞、功能失常，甚至危及生命。臨床表現(xiàn)復(fù)雜，稱為“great imitator”，與很多疾病的臨床表現(xiàn)和癥狀不易區(qū)分。5-15×0.1-0.2um，形似細密的彈簧，螺旋彎曲規(guī)則，平均

2、8-14個，兩端尖直，運動活潑。G-，但不易著色。Giemsa染色紅色，銀染色呈棕褐色。,,,,,,傳播途徑,性接觸是主要的傳染途徑 未經(jīng)治療的患者在感染后的1年內(nèi)最具有傳染性 隨著病期的延長，傳染性越來越小？？ 到感染后2年，通過性接觸一般無傳染性？？母嬰傳播 在妊娠7周時，梅毒螺旋體即可通過胎盤傳染未經(jīng)治療者，雖已無性傳播（病期>2年），但妊娠時仍可傳染給胎兒，病期越長，傳染性越小;輸血傳染,臨床分期（CDC

3、）,一期：發(fā)生在感染后10-90天二期：在硬下疳出現(xiàn)的2-10周隱性梅毒（潛伏期梅毒：潛伏早期和潛伏晚期）：無臨床癥狀，發(fā)生在一期和二期癥狀消失后，可持續(xù)幾年。早期潛伏期梅毒能復(fù)發(fā)到二期梅毒 三期：感染后的10-20年神經(jīng)梅毒：可發(fā)生在梅毒的任何一期先天梅毒：通過胎盤感染胎兒,臨床分期(梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn)),一期梅毒：硬下瘡（潛伏期2周一4周），腹股溝或患部近衛(wèi)淋巴結(jié)腫大。二期梅毒：可有一期梅毒史，病期在2年以內(nèi)。皮損，全

4、身淺表淋巴結(jié)腫大， 可出現(xiàn)梅毒性骨關(guān)節(jié)損害、眼損害、內(nèi)臟及神經(jīng)系統(tǒng)損害等。三期梅毒（晚期梅毒）：可有一期或二期梅毒史。病期2年以上。 晚期良性梅毒：皮膚黏膜損害，骨梅毒、眼梅毒、其他內(nèi)臟梅毒。神經(jīng)梅毒，心血管梅毒隱性梅毒（早期和晚期）：無任何梅毒性的癥狀和體征早期隱性梅毒：病期在2年內(nèi)， 晚期隱性梅毒：病期在2年以上。胎傳梅毒（先天梅毒）：生母為梅毒患者或感染者,梅毒的診斷,診斷依據(jù)流行病學(xué)臨床表現(xiàn)實驗室檢查,梅毒螺旋體

5、不能培養(yǎng)早期梅毒應(yīng)用直接檢測方法，但假陰性率高（達30%）大多數(shù)現(xiàn)癥病人無臨床表現(xiàn)或臨床表現(xiàn)不明顯梅毒的診斷必須要用血清學(xué)方法檢測非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗,二、梅毒感染現(xiàn)狀,,,本地區(qū)梅毒螺旋體感染情況,近年患者TPAb和TRUST陽性率,本地區(qū)梅毒感染情況總結(jié),梅毒感染呈現(xiàn)逐年增多趨勢女性多于男性年齡分布主要集中在20-40歲之間梅毒患者多來自門診，但不自覺的現(xiàn)癥感染者逐漸增加。

6、 注：非嚴(yán)謹(jǐn)統(tǒng)計數(shù)據(jù)！,三、梅毒的實驗室檢測,,,梅毒實驗室檢測,直接檢測（病原學(xué)檢測）血清學(xué)檢測,直接檢查方法（病原學(xué)檢測）,兔感染試驗 (RIT)顯微鏡檢測暗視野檢查(DF) 鍍銀染色法直接熒光法PCR,兔感染試驗,原理：梅毒螺旋體感染兔的睪丸或眼結(jié)膜感染材料：腦脊液，羊水，損傷部位分泌物，淋巴結(jié)抽吸物敏感特異報告1-2個細菌即可感染有價值，但臨床檢測欠實用,梅毒螺旋體暗視野檢查,原理聚光器中央黑漆

7、遮蔽，光線只可從其圓周邊緣斜角射到載玻片上。若斜射光線遇到載玻片上的螺旋體等會發(fā)光顯現(xiàn)。取材：同前，(但要除口腔損傷部位的取材!)敏感性：105 Tp/mL特異性：技術(shù)人員水平和 操作熟練程度,直接熒光抗體染色和鍍銀染色,原理：梅毒抗體或抗抗體標(biāo)記熒光物質(zhì)，與涂片中的梅毒螺旋體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，熒光顯微鏡下觀察熒光形態(tài)。取材:損傷部位涂片，濃縮體液，組織刷片，固定或非固定組織特異性

8、：與抗體有關(guān)（單克隆，多克隆抗體）敏感性：與梅毒螺旋體數(shù)量相關(guān)，單克隆抗體檢測福爾馬林固定的組織時優(yōu)于多克隆抗體 無SFDA批準(zhǔn)的商品試劑（熒光抗體）,TP核酸檢測,原理：擴增梅毒螺旋體特異的DNA或RNA序列取材：除之前標(biāo)本外，還可檢測血清，血漿敏感性：不同標(biāo)本差異很大特異性：與引物設(shè)計 ，人員技術(shù)，實驗條件有關(guān)。無SFDA批準(zhǔn)的商品試劑盒,,,直接檢測的建議,暗視野法適用于一二期梅毒檢測，但要注意區(qū)別口腔螺旋體和其它

9、共生螺旋體。血清學(xué)檢測始終要與直接檢測聯(lián)合應(yīng)用，直接檢測陽性不等于血清學(xué)陽性，但仍然應(yīng)該作為梅毒陽性。對高度懷疑為梅毒患者，如果血清學(xué)和DF陰性，可選擇性應(yīng)用DFA-TP和 PCR。PCR對對血液，血清，血漿和CSF檢測作用有限。 新生兒腦脊液兔感染實驗（RIT）檢測梅毒非常敏感，RIT和PCR檢測羊水有相同的敏感性 。注意病原學(xué)直接檢測的安全,病原學(xué)檢查的臨床意義,病原學(xué)方法直接鏡檢到梅毒螺旋體，在臨床可確診梅毒，且具有快速

10、、方便、易操作的特點。 螺旋體檢查是診斷早期現(xiàn)癥梅毒的最佳方法，對于患者的早期診斷、及時治療、預(yù)后和盡早切斷傳染源都有十分重要的意義。 如未見到梅毒螺旋體，并不能排除患梅毒的可能性。,梅毒血清學(xué)檢測方法,梅毒血清學(xué)檢測原理,當(dāng)人體感染梅毒螺旋體后4周～10周左右，血清中可產(chǎn)生一定數(shù)量的抗類脂質(zhì)抗原的非特異性反應(yīng)素（主要是IgM、IgG）和抗梅毒螺旋體抗原的特異性抗體（主要是IgM、IgG)。,梅毒抗體產(chǎn)生時間,梅毒血清學(xué)試驗分類

11、,非梅毒螺旋體抗原血清試驗（非特異性梅毒抗體）VDRL、USR、RPR、TRUST梅毒螺旋體抗原血清試驗（特異性梅毒抗體）TPHA、TPPA、FTA-ABS、ELISA、CIA、ICA、WB,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗,原理：梅毒螺旋體一旦感染人體，人體迅速對被損害的宿主細胞以及梅毒螺旋體細胞表面所釋放的類脂物質(zhì)作出免疫應(yīng)答，在3周～4周產(chǎn)生抗類脂抗原的抗體（反應(yīng)素reagin）。這些抗體主要是IgG和1gM型混合抗體?？贵w

12、作用無保護作用，治療監(jiān)測。未經(jīng)治療的病人，其血清內(nèi)的反應(yīng)素可長期存在。經(jīng)正規(guī)治療后，反應(yīng)素可以逐漸減少至轉(zhuǎn)為陰性。,試驗方法,VDRL venereal disease research laboratory 性病研究實驗室（玻片試驗）USR unheated serum reagin 血清不需加熱的反應(yīng)素（玻片試驗）TRUST toluidine red unheated serum test 甲苯胺紅血清不需加熱試驗RPR

13、rapid plasma reagin 快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗,實驗原理,心磷脂、卵磷脂及膽固醇+反應(yīng)素=絮狀凝集心磷脂：形成抗原抗體反應(yīng)卵磷脂：可加強心磷脂的抗原性膽固醇：可增強抗原的敏感性。VDRL、 USR、 RPR和TRUST所采用的抗原成分相同，敏感性和特異性基本相似。,注意事項,實驗環(huán)境溫度應(yīng)為23 C--29℃，抗原4℃保存冰箱，防止凍結(jié)。校準(zhǔn)針頭，抗原為60士1滴／mL水平旋轉(zhuǎn)儀。試驗完畢，應(yīng)

14、立即觀察結(jié)果。注意定性試驗的“前帶”現(xiàn)象,非梅毒螺旋體血清學(xué)試驗流程,100轉(zhuǎn)/MIN±5轉(zhuǎn)幅約18mm,注意定性試驗的“前帶”現(xiàn)象,非梅毒螺旋體血清學(xué)試驗結(jié)果判讀,,,,,,,,,臨床意義,對一期梅毒的敏感性為74%～87%，二期梅毒達100%，三期梅毒34% ～ 94%。特異性96% ～ 99%。適用于各期梅毒的診斷。早期梅毒經(jīng)治療后血清滴度可下降或轉(zhuǎn)陰，故可用于療效觀察、判愈、判定復(fù)發(fā)或再感染。VDRL試驗適用

15、于神經(jīng)梅毒的腦脊液檢查，特異性高，但敏感性低。,臨床意義,早期梅毒（一期、二期）經(jīng)足量規(guī)則抗梅毒治療后3個月，VDRL試驗抗體滴度下降2個稀釋度，6個月下降4個稀釋度。 一期梅毒1年后轉(zhuǎn)為陰性 二期梅毒2年后轉(zhuǎn)為陰性。 晚期梅毒治療后血清滴度下降緩慢，2年后約50%病人血清反應(yīng)仍為陽性。,假陽性問題,技術(shù)性假陽性由于標(biāo)本的保存不當(dāng)（如細胞污染或溶血）、試劑質(zhì)量差或過期、或?qū)嶒炇也僮麇e誤所造成。生物學(xué)假陽性 (biologic

16、al false-positive ,BFP) 是由于患者有其他疾病或生理狀態(tài)發(fā)生變化，使梅毒血清試驗出現(xiàn)陽性,生物學(xué)假陽性原因,妊娠SLE產(chǎn)生β2 - 糖蛋白依賴性抗心磷脂抗體, 梅毒產(chǎn)生的抗體為非β2- 糖蛋白依賴性抗心磷脂抗體, 兩種抗心磷脂抗體之間偶可出現(xiàn)交叉反應(yīng)自身免疫性疾病EBV 感染萊姆關(guān)節(jié)炎由伯氏疏螺旋體所致的自然疫源性疾病,生物學(xué)假陽性原因,腫瘤可能是某些腫瘤抗原與心磷脂抗原存在相似的表位, 或者腫瘤患

17、者體內(nèi)產(chǎn)生的抗腫瘤抗體能與心磷脂抗原發(fā)生交叉反應(yīng)牙周病齒垢螺旋體 老年人（可能與老年人多牙周病有關(guān)）,血清固定,耐血清性（血清固定）指經(jīng)抗梅毒治療后，非梅毒螺旋體抗原血清試驗在一定時期內(nèi)不陰轉(zhuǎn)。早期的耐血清性常與治療量不足或不規(guī)則治療、復(fù)發(fā)、再感染或有神經(jīng)系統(tǒng)梅毒等因素有關(guān)。,梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗,試驗原理與檢測方法,原理檢測血中特異性抗梅毒螺旋體特異蛋白抗體（ IgG 和IgM ）。特異性IgM型抗梅毒螺旋體抗體，感染

18、2周后即可測出。 檢測方法TPPA、TPHA、TP-ELISA、ICA、FTA-ABS、CIA、WB,TPPA/TPHA,原理用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒（雞/綿羊紅細胞），此致敏顆粒與人血清中的抗梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生可見的凝集反應(yīng)。明膠顆粒為玫瑰紅色，便于肉眼觀察結(jié)果。特點將梅毒螺旋體超聲裂解，純化抗原疑問：抗原的成分，如何標(biāo)準(zhǔn)化？,TPPA原理示意圖,TPPA試驗是檢測梅毒的“金標(biāo)準(zhǔn)”試驗？,熒光螺旋體抗體吸收試驗（

19、FTA-ABS）,原理以完整形態(tài)的Nichol梅毒螺旋體作為抗原，加上經(jīng)吸收劑（用Reiter株螺旋體制備而成）處理過的患者血清形成抗原抗體復(fù)合物，再加人熒光素（FITC）標(biāo)記的抗人免疫球蛋白，與血清梅毒螺旋體抗體結(jié)合。在熒光顯微鏡下，螺旋體顯示蘋果綠色的熒光，即為陽性反應(yīng)。,,FTA-ABS試驗是檢測梅毒的“金標(biāo)準(zhǔn)”試驗？,酶聯(lián)免疫吸附試驗,原理該試驗是用經(jīng)純化及超聲裂解處理的梅毒螺旋體為抗原包被固相板條，加上梅毒血清和辣根過氧化

20、酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，利用酶免疫法檢測患者血清中的抗梅毒螺旋體特異性抗體。用重組梅毒螺旋體抗原包被固相板條，加上梅毒血清和酶標(biāo)記抗原物（或抗人IgG抗體），形成抗原抗體復(fù)合物與酶標(biāo)記物結(jié)合，用酶聯(lián)檢測儀判定試驗陽性反應(yīng)。檢測IgG還是IgM？,免疫層析（膠體金）,POCT,Point-of care tests (POC) have contributed major advances to syphilis control

21、in developing countries with a high prevalence of disease. POC testing has the potential to play a similar role in the US, but probably not using any of the existing tests. Although sensitivities (+95%) and specificities

22、 (+98%) of POC tests are comparable to other treponemal tests21,22, existing tests have very low positive predictive values (<50%) in detecting active disease in low prevalence settings23, thereby resulting in a high

23、number of over treatments and unnecessary stress on patients and their contacts. In certain high prevalence settings, where immediate treatment is the overriding concern due to a likely lack of follow up care, the existi

24、ng treponemal POCs may prove to be better than no test at all; however, at this time POC tests cannot be recommended for general use in the United States.,免疫印跡法,用于體外定性檢測人血清或血漿中的抗梅毒螺旋體抗體IgG(包括梅毒特異性抗體IgG、非梅毒特異性的抗心磷脂抗體IgG)。

25、,,,,方法特點,特異性強，敏感性高，很少出現(xiàn)假陽性。假陽性 如系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清可使FTA-ABS試驗呈假陽性反應(yīng)，但大多數(shù)病例中螺旋體呈串株狀熒光。 傳染性單核細胞增多癥，可能由于嗜異性抗體所致，可使TPHA呈假陽性。麻風(fēng)患者也可使特異試驗呈陽性。,假陽性問題,存在交叉反應(yīng)的抗體（異嗜性抗體）處理方法：用Reiter株吸收血清中交叉反應(yīng)的抗體?。老年人陽性問題真陽性 假陽性：這些老年患者所患的基礎(chǔ)疾病可

26、能使機體釋放誘導(dǎo)產(chǎn)生抗類脂抗體和/或抗T.pallidum抗體的交叉抗原；,臨床意義,作為RPR初篩陽性標(biāo)本的確證試驗，不能作為療效觀察的指標(biāo)。陽性不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，應(yīng)結(jié)合RPR結(jié)果進行診斷。梅毒螺旋體抗原血清試驗的敏感性和特異性均高，一期梅毒的敏感性為70%-l00%，二期梅毒達100%，三期梅毒95％-98%，特異性94％-100%。梅毒螺旋體抗原血清試驗多用作證實試驗（區(qū)分不同方法），特別是隱性梅毒及一些非螺旋體抗

27、原血清試驗陰性而又懷疑為梅毒的患者。但不能用于療效觀察和判斷復(fù)發(fā)及再感染。,梅毒血清學(xué)試驗結(jié)果解釋,梅毒血清學(xué)試驗結(jié)果的臨床意義,,非梅毒螺旋體血清學(xué)試驗結(jié)果解釋示意圖,,,,,,,陽性 陰性,,,梅毒螺旋體血清學(xué)試驗結(jié)果解釋示意圖,,,,,,,陽性 陰性,,,,,,先天梅毒實驗室檢查,查到梅毒螺旋體特異性梅毒IgM陽性心磷脂

28、抗體滴度持續(xù)上升心磷脂抗體滴度高于其母親的四倍（2個滴度）隨訪18個月觀察特異性抗體的變化.CDC性病控制中心,A combination of IgM and direct Tp detection from multiple sites as well as the use of a treponemal test at >12 months will identify many or most infants wi

29、th congenital syphilis. Testing for specific IgM antibodies is useful if the test is reactive, but in cases where the test is nonreactive it does not rule out congenital syphilis. IgM may be used in concert with Tp dete

30、ction through immunostaining, PCR or DF microcopy. A four-fold or greater ratio of neonatal to maternal titers is rarely useful. APHL專家共識,神經(jīng)梅毒實驗室檢查,血清學(xué)檢查可能預(yù)示無癥狀的神經(jīng)性梅毒（RPR > 1:32 ）VDRL 用于CSF檢查，其它包括CSF WBC cut-offs（W

31、BC≥106/L，Pro＞500 mg/L且無其他引起這些異常的原因）， TP-PA (1:320), CXCL13. 蛋白水平和 TPHA 滴度不用于腦脊液檢查。 聯(lián)合檢測 CSF（VDRL試驗或FTA-ABS試驗）,,??,??,??,梅毒血清學(xué)試驗適用范圍,CDC：傳統(tǒng)梅毒篩查檢測策略,CDC：現(xiàn)梅毒篩查檢測策略,如果懷疑為潛伏期和一期梅毒的青霉素治療,結(jié)合臨床癥狀和流行病學(xué)診斷和治療決策,結(jié)合臨床癥狀和流行病學(xué)診斷和治療決策

32、,EIA和CIA方法梅毒檢測策略,,A: Assay所有方法檢測結(jié)果7日內(nèi)報告！,我國梅毒實驗室檢測策略,梅毒實驗室檢測策略,策略一采用任何一種非梅毒螺旋體抗原血清試驗對樣品進行初篩,策略二采用任何一種梅毒螺旋體抗原血清試驗對樣品進行初篩,策略一,策略二,？,？,,策略一和策略二比較,策略一：非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗優(yōu)點：簡便，經(jīng)濟缺點：主觀，勞動強度大，生物安全風(fēng)險策略二：梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗優(yōu)點：簡便

33、 、經(jīng)濟、大樣本篩查快速、結(jié)果客觀、可自動化缺點：無確診方法,五、小結(jié),,,小結(jié),可作為梅毒感染篩查，經(jīng)濟簡便但勞動強度大陽性往往是梅毒現(xiàn)癥感染者，臨床上即可開展治療。定量試驗可作為療效觀察的指標(biāo)。陰性不能排除梅毒現(xiàn)癥感染特異性和敏感性在不同階段梅毒表現(xiàn)不同，一期和二期均較高，三期梅毒不定。存在生物學(xué)假陽性,可作為梅毒感染篩查，經(jīng)濟簡便陽性不能確定是否梅毒現(xiàn)癥感染者，不能作為治療和療效觀察的指標(biāo)。特異性和敏感性高。存在生

34、物學(xué)假陽性可作為非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗的確診試驗。,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗,梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗,小結(jié),培訓(xùn)，標(biāo)準(zhǔn)化操作，杜絕有個人特點的操作。對于只做RPR/TRUST的報告要注意以下情況：定性檢測陰性=陰性；陰性=“前帶”現(xiàn)象，慎重報告結(jié)果。陽性=陽性；陽性=“生物學(xué)假陽性”，強烈建議加做特異性抗體的檢測。對ELISA/CIA陽性的加做RPR/TRUST定量檢測，如果RPR/TRUST-,建議復(fù)查，排除梅毒感染

35、早期。對于不一致結(jié)果（ELISA/CIA+/ TPPA -）或低值的ELISA/CIA陽性結(jié)果，考慮復(fù)查。,小結(jié),梅毒抗原血清學(xué)試驗沒有金標(biāo)準(zhǔn)。FTA-ABS結(jié)果判讀較為主觀，與個人技術(shù)水平相關(guān)。免疫印跡法作為金標(biāo)準(zhǔn)可能是一個好的候選方法。梅毒抗原血清學(xué)試驗的快速檢測法（ ICA）僅推薦在沒有其它方法的實驗室使用，如果實驗室有其它梅毒抗原血清學(xué)試驗方法不推薦使用。特異性TP-IgM 檢測在一期梅毒和先天梅毒的診斷中有潛在的應(yīng)用