遺傳病的診斷

1、醫(yī)學遺傳學,遺傳病的診斷 Diagnosis of Genetic Disease,第一節(jié) 臨癥診斷和癥狀前診斷,臨癥診斷（symptomatic diagnosis）是根據(jù)患者的各種臨床表現(xiàn)進行檢查、確診和判斷遺傳方式，是遺傳病診斷的主要內(nèi)容。癥狀前診斷（presymptomatic diagnosis）則是對遺傳上異常的個體采用各種措施，使他們在出現(xiàn)癥狀前從遺傳上予以確認。,一、病史、癥

2、狀和體征 病史癥狀與體癥,二、家系分析 根據(jù)對患者及家族成員發(fā)病情況的調(diào)查結(jié)果繪制系譜，大大有助于區(qū)分單基因病和多基因病，以及遺傳方式。,三、細胞遺傳學檢查 細胞遺傳學檢查，即染色體檢查與核型分析，是應用較早的遺傳病診斷手段。隨著顯帶技術，特別是高分辨染色體顯帶技術的出現(xiàn)和改進，能夠更準確地判定和發(fā)現(xiàn)更多的染色體畸變，確診新的微小畸變綜合征。,四、生化檢查生化檢查是遺傳病診斷中的重要輔助手段，包括臨床生化檢驗和針對遺傳病的特

3、殊檢查，主要是對由于基因突變所引起的酶和蛋白質(zhì)定量和定性分析，對單基因病和先天性代謝病進行診斷。,五、基因診斷 利用分子生物學技術，檢測DNA、RNA結(jié)構(gòu)或基因表達水平變化，從而對疾病做出診斷的方法，稱為基因診斷。,第二節(jié) 產(chǎn)前診斷和植入前診斷,產(chǎn)前診斷（prenatal diagnosis）是以羊膜穿刺術和絨毛取樣等技術，對羊水、羊水細胞和絨毛進行遺傳學和生化檢查分析，對胎兒的染色體和基因進行分析診斷，是預防遺傳病患兒出生的有效手段

4、。,一、產(chǎn)前診斷的對象 ①夫婦之一有染色體畸變，特別是平衡易位攜帶者，或生育過染色體病患兒的夫婦；②35歲以上的孕婦；③夫婦之一有開放性神經(jīng)管畸形，或生育過這種畸形患兒的孕婦；④夫婦之一有先天性代謝缺陷，或生育過這種患兒的孕婦；⑤X連鎖遺傳病致病基因攜帶者孕婦；⑥有習慣性流產(chǎn)史的孕婦；⑦羊水過多的孕婦；⑧夫婦之一有致畸因素接觸史的孕婦；⑨有遺傳病家族史，又系近親結(jié)婚的孕婦。,二、產(chǎn)前診斷的方法 產(chǎn)前診斷的常規(guī)方法

5、有無創(chuàng)性和有創(chuàng)性兩類，無創(chuàng)性方法有B超檢查，孕婦血液與尿液檢測，CT、X線和核磁共振等；有創(chuàng)性方法有羊膜穿刺、絨毛取樣和胎兒鏡等。,B超是一種相對安全無創(chuàng)的檢測方法，是首選的診斷方法，能夠詳細檢查胎兒的外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，可對多種遺傳性疾病進行早期診斷，這些疾病包括，神經(jīng)管缺陷、腦積水、無腦畸形；唇、腭裂，頸部淋巴管瘤；先天性心臟病；支氣管、肺部發(fā)育異常，胸腔積液；肢體缺陷；先天性單側(cè)腎缺如、多囊腎；先天性幽門狹窄、先天性巨結(jié)腸等。,

6、羊膜穿刺技術 是產(chǎn)前診斷的基本方法之一，即在B超的監(jiān)護與引導下，無菌抽取胎兒羊水，對羊水中的胎兒脫落細胞培養(yǎng)，進行染色體、基因和生化分析。例如，羊水中甲胎蛋白濃度過高時，提示胎兒可能有脊柱裂、脊髓脊膜膨出和腦積水等異常。羊膜穿刺操作一般在妊娠15～17周進行，發(fā)生感染、流產(chǎn)及其他婦科合并癥的風險相對較?。s1%）。,羊膜穿刺示意圖,絨毛取樣法 在妊娠早期診斷中最為常見，一般于妊娠10～11周進行。該技術也是在

7、B超監(jiān)護下，用特制的取樣器，從孕婦陰道經(jīng)宮頸進入子宮，沿子宮壁到達取樣部位后，吸取絨毛枝。絨毛取樣的優(yōu)點是檢查時間早，根據(jù)檢測結(jié)果認為有必要進行選擇性流產(chǎn)時，給孕婦帶來的損傷和痛苦相對較小。缺點是取樣標本容易被污染，胎兒和母體易感染和操作不便等，引起流產(chǎn)的風險是羊膜穿刺法的2倍。,絨毛樣本可用于診斷染色體病，代謝病，胎兒性別鑒定，生化檢測和DNA分析。,絨毛取樣法示意圖,臍穿刺 是在B超的監(jiān)護下，用細針經(jīng)腹壁、子宮

8、壁進入胎兒臍帶，并抽取胎兒血液樣本進行診斷。本方法適宜妊娠18周進行，常作為因錯過絨毛或羊膜穿刺取樣最佳時機，或羊水檢查失敗的補救措施，還可檢測胎兒血液系統(tǒng)疾病，先天性免疫缺陷等。,胎兒鏡檢查 又稱羊膜腔鏡或?qū)m腔鏡檢查。宮腔鏡進入羊膜腔后，直接觀察胎兒是否有畸形、性別和發(fā)育狀況如何，可以同時抽取羊水或胎兒血樣進行檢查，還可進行宮內(nèi)治療。因此，理論上這是一種最為理想的方法。但由于操作困難和易引起多種并發(fā)癥，目前還不能被廣泛接受。胎兒鏡

9、檢查的最佳時間是妊娠18～20周。,分析孕婦外周血中的胎兒細胞以及游離的胎兒DNA或RNA 利用妊娠期少量胎兒細胞可以通過胎盤進入母體血液中這一現(xiàn)象，采用流式細胞儀分離、磁激活細胞分選、免疫磁珠法、顯微操作分選法以及分子細胞遺傳學技術等，分離和分析胎兒有核細胞以及血清中游離的胎兒DNA或RNA，從而進行無創(chuàng)性基因診斷。,三、植入前診斷 PGD技術是指在體外受精的胚胎，發(fā)育到4～8細胞期，通過顯微操作技術取出單個卵裂球細胞

10、，應用PCR、FISH等技術進行快速的遺傳學分析，包括染色體檢查、特定基因檢測，性別鑒定，正常的胚胎植入母體子宮。,第四節(jié) 分子診斷,利用分子生物學技術，檢測DNA、RNA結(jié)構(gòu)或基因表達水平變化，從而對疾病做出診斷的方法，稱為基因診斷（gene diagnosis）。,1978年，華裔美國學者簡悅威（Yuet-Wai Kan）首次采用DNA重組技術對血紅蛋白病進行產(chǎn)前診斷，開創(chuàng)基因診斷的先河。目前，基因診斷早已進入歐美各國的臨床應用，不

11、僅針對遺傳性疾病，而且用于對一些感染性疾病和腫瘤的診斷。,基因診斷具有以下特點：以特定基因為目標，檢測基因的突變和表達信息，特異性強；采用分子雜交技術和PCR技術具有信號放大作用，微量樣品即可進行診斷，靈敏度高；可用于尚無出現(xiàn)臨床表現(xiàn)前，胎兒的出生前診斷，群體篩查等，應用廣泛；檢測樣品獲得便利，不受個體發(fā)育階段性和基因表達組織特異性的限制。,一、基因診斷的主要方法 基因診斷主要采用核酸分子雜交、PCR和DNA測序等技術

12、。,核酸分子雜交技術 是檢測樣品中是否存在相應的基因以及相應基因的表達狀態(tài)等。其中Southern印跡法主要用于基因組DNA的分析，Northern印跡法用于檢測樣品中RNA的種類和含量。,斑點印跡雜交 把待檢測的核酸樣品點在尼龍膜上，變性后與標記的探針進行結(jié)合反應，經(jīng)過顯色和顯影后檢測雜交信號的強度，與對照比較后確定所測核酸量的高低。根據(jù)尼龍膜上所點核酸樣品的種類不同，分為DNA dot blotting和 RNA

13、 dot blotting。,原位雜交 把組織或細胞樣品經(jīng)過適當處理，用探針與核酸進行雜交。這種方法不需要提取核酸，可以確定被檢核酸在組織或細胞，以及中期染色體上的定位，具有重要的生物學和病理學意義。,PCR-ASO ASO為等位基因特異性寡核苷酸雜交法的簡稱。根據(jù)已知基因突變位點的堿基序列，設計和制備與野生型或突變型基因序列互補的兩種探針，分別與被檢測者樣品中的DNA分子進行雜交，根據(jù)樣品與兩種探針雜交信號的強

14、弱，確定是否存在基因突變，判斷被檢者是突變基因的純合體或雜合體 。,基因芯片技術 基因芯片技術是近年來發(fā)展迅速的大規(guī)模、高通量分子檢測技術?；具^程是將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，如玻片、硅片或尼龍膜等，形成矩陣點。樣品DNA/RNA通過PCR擴增、體外轉(zhuǎn)錄等技術摻入熒光標記分子，然后與待測樣本進行雜交反應，再通過激光共聚焦熒光顯微鏡對芯片進行掃描，經(jīng)計算機系統(tǒng)分析處理所得資料，對上

15、千種甚至更多基因的表達水平、突變和多態(tài)性進行快速、準確的檢測。,基因芯片可以進行微量化、大規(guī)模、并行化、高度自動化地處理有價值的生物樣品，精細地研究各種狀態(tài)下分子結(jié)構(gòu)變異，了解組織細胞基因表達情況。既可檢測基因的多態(tài)性，又能檢測基因突變，特別適用于多個基因、多個位點的同時檢測。這一技術目前處于發(fā)展和優(yōu)化階段，已經(jīng)有多種針對遺傳性疾病、腫瘤檢測的基因芯片用于臨床診斷。,其他常用的技術 PCR-RFLPPCR 利用一對或數(shù)對特異性引

16、物，將目標DNA擴增；酶切 利用某些限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，如PCR產(chǎn)物中 含有相應的酶切位點序列，DNA鏈則被切開；電泳 利用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠分離酶切后的 PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳圖譜判斷結(jié)果。,PCR-SSCP 當雙鏈DNA變性為兩條單鏈后，各自會在中性條件下形成各自特定的空間構(gòu)象，因而在電泳時將在不同的位置上出現(xiàn)各自電泳條帶。如果DNA序列發(fā)生變化，甚至只有一個堿基

17、變化，空間構(gòu)象也有可能發(fā)生變化，電泳條帶也隨之變化。,PCR-SSCP,RT-PCR 以mRNA為模板合成cDNA，再進行PCR，用于基因表達水平的檢測和分析。,DHPLC即變性高效液相色譜分析（denaturing high-performance liquid chromatography） 幾乎為每一個基因診斷室所必備。DHPLC用于DNA序列變異的檢測，其本質(zhì)上是用離子對反相HPLC進行DNA雜合雙鏈片段分析。

18、,Western blot法 Western blot印跡技術是檢測特定蛋白質(zhì)的方法，可用于某種與遺傳病相關的蛋白質(zhì)定性定量分析。如假肥大型肌營養(yǎng)不良（DMD）患者基因缺陷使肌細胞的dystrophin蛋白合成異常，采用Western blot法可對患者dystrophin蛋白進行檢測。,二、基因診斷技術的應用基因診斷在遺傳病中的應用例如：鐮狀細胞貧血的基因診斷酶解正常人DNA和患者DNA，用標記的?珠蛋白基因為探針

19、作Southern雜交,鐮狀細胞貧血的基因診斷限制性內(nèi)切酶MstⅡ切割的序列是CCTNAGG （其中N是任何一種核苷酸），切割正常DNA產(chǎn)生1.1kb ?珠蛋白的DNA片段；若切割患者DNA時，由于A?T破壞了MstⅡ的位點，便形成1.3kb ?珠蛋白的DNA片段。,例如：血友病A的基因診斷 PCR技術與RFLP相結(jié)合的方法。首先用PCR技術將包含突變DNA的片段擴增出來，然后用識別該位點的限制酶來酶解，電泳后直接檢測多態(tài)性位

20、點的狀態(tài)。,基因診斷在腫瘤中的應用ras基因突變的檢測 ras基因突變的檢測可采用PCR-ASO方法進行，已知ras基因突變的熱點在12、13及61密碼子。 p53基因的檢測 目前常用PCR法進行檢測p53突變的熱點是外顯子5-8，一般可先選用外顯子5-8的引物進行擴增，其后再進行突變位點的詳盡分析，甚至測序。另一初步檢測p53基因突變的方法為PCR-SSCP，然后測序。,帕金森病基因診斷家系研究 連鎖基因的研究