兩種線(xiàn)狀病毒分子變異的研究及熱處理對(duì)梨基因表達(dá)的影響.pdf

1、本研究對(duì)來(lái)源于中國(guó)的砂梨和加拿大溫室與作物加工研究中心國(guó)家種質(zhì)資源圃蘋(píng)果和西洋梨的蘋(píng)果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus ACLSV）分離物和核果類(lèi)上的櫻桃綠環(huán)斑駁病毒（Cherry green ring mottle virus，CGRMV）分子變異進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，明確了蘋(píng)果褪綠葉斑病毒和櫻桃綠環(huán)斑駁病毒的分子變異情況以及進(jìn)化上的親緣關(guān)系，為蘋(píng)果、梨和核果類(lèi)病毒的發(fā)生、防治奠定了基礎(chǔ)。栽培

2、無(wú)病毒種苗是減輕這些病毒危害的重要途徑，熱處理技術(shù)也廣泛應(yīng)用于無(wú)病毒果樹(shù)種質(zhì)培育中。為探索適合梨病毒的脫毒處理?xiàng)l件，建立更加有效的脫毒技術(shù)，本研究分析了熱處理對(duì)病毒在離體植株中分布的影響，結(jié)果表明高溫降低莖尖病毒濃度，對(duì)基部無(wú)影響，這種作用的不均勻性是否觸發(fā)了熱處理的某些抗性機(jī)制仍不清楚，進(jìn)而以熱處理和正常培養(yǎng)砂梨離體植株為研究體系，構(gòu)建cDNA差減文庫(kù)，篩選熱處理誘導(dǎo)下與病毒互作的相關(guān)基因，深入分析熱處理對(duì)病毒生活史及植物基因表達(dá)解析

3、熱處理脫除機(jī)制。取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.本研究采用生物學(xué)法和RT-PCR對(duì)加拿大溫室與作物加工研究中心國(guó)家種質(zhì)資源圃核果類(lèi)110個(gè)樣品檢測(cè)，結(jié)果表明8個(gè)樣品感染CGRMV，并首次發(fā)現(xiàn)了CGRMV侵染李寄主。對(duì)擴(kuò)增的8個(gè)CGRMV分離物的CP基因編碼的氨基酸進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明CP基因變異很大，分離物之間的氨基酸同源性為90～100％，在進(jìn)化親緣關(guān)系上CGRMV分離物可以分為兩個(gè)組群。
　　 2.加拿大溫室與

4、農(nóng)作物加工研究中心的國(guó)家種質(zhì)資源圃梨和蘋(píng)果四種主要病毒的檢測(cè)結(jié)果，采用DAS-ELISA對(duì)采集的438份蘋(píng)果和122份梨樣品進(jìn)行四種主要病毒ACLSV、蘋(píng)果莖溝病毒（Apple stem grooving virus，ASGV）、蘋(píng)果莖痘病毒（Aple stem pitting virus，ASPV）和蘋(píng)果花葉病毒（Apple mottle virus，ApMV）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，病毒復(fù)合感染現(xiàn)象普遍，其中ACLSV發(fā)生最普遍，其檢出

5、率達(dá)40％左右，梨樣品嚴(yán)重感染了ASPV和ApMV，帶毒率高于90％。以總RNA為模板，在檢測(cè)體系中引入nad5基因作為內(nèi)標(biāo)的多重RT-PCR對(duì)17份蘋(píng)果樣品的四種主要病毒進(jìn)行復(fù)檢，均能擴(kuò)增四種病毒的特異性目標(biāo)片斷，檢測(cè)效果較ELISA好。
　　 3.ACLSV3'端基因的分子變異研究，以ACLSV-6860/ACLSV-7536為引物，采用改進(jìn)的CTAB法提取總RNA為模板的RT-PCR對(duì)來(lái)源于加拿大22個(gè).ACLSV分離物和

6、采用TC-RT-PCR法病毒粗提液為模板對(duì)來(lái)源于中國(guó)24個(gè)ACLSV分離物的3'端基因進(jìn)行擴(kuò)增、純化、克隆和測(cè)序。序列測(cè)定表明，目標(biāo)片斷大小為680bp左右，該序列包含3'端CP基因（500nt，占CP核苷酸序列的85％）和3'端NCR.序列。對(duì)加拿大22個(gè)ACLSV分離物的擴(kuò)增片斷進(jìn)行了序列分析，結(jié)果表明，22個(gè)ACLSV分離物的核苷酸序列同源性為84～100％，其中11個(gè)分離物序列同源性為100％。參照?qǐng)?bào)道來(lái)源于不同國(guó)家不同寄主的A

7、CLSV分離物的序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，加拿大ACLSV分離物分為2個(gè)組群，分離物Malus0422、Malus0908和Malus0422與來(lái)源日本P205位于同一組群，屬于P205型，CP基因編碼的氨基酸具有Ala14-Va133-Phe49-Ser104-Met158的保守序列特點(diǎn)，其余19個(gè)分離物位于另一個(gè)組群的兩個(gè)不同分支，屬于B6型，CP氨基酸具有保守序列Ser14-Leu33-Tyr49-Thr104-Leu158的特點(diǎn)。對(duì)來(lái)

8、源于中國(guó)砂梨的20個(gè)分離物和來(lái)源于蘋(píng)果和桃子上的4個(gè)分離物與Genbank上登錄的來(lái)源于不同國(guó)家和不同寄主的分離物序列進(jìn)行同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，本研究的24個(gè)ACLSV分離物屬于B6型，進(jìn)化樹(shù)分析分為兩個(gè)組群，兩組群之間苷酸和氨基酸同源性為86.3～87.5％和94.0～96.4％。擴(kuò)增片斷為686bp、來(lái)源于砂梨的的XSJ，SMJ，QX，PL，CL，QYS，GY和蘋(píng)果C-AP之間同源性為95～99％的8個(gè)分離物，親緣關(guān)系較近在進(jìn)

9、化樹(shù)中歸為為同一組群；擴(kuò)增片斷為680bp，來(lái)源于砂梨ZY，JS1,ZSZ，HL1,JQ，F(xiàn)S，SY，BY61-7-7，CX，CS和1個(gè)桃子C-P之間同源性為96～100％的12個(gè)分離物與來(lái)源于砂梨的XG、HL2和2個(gè)桃子（C-XA和C-HB）之間同源性為95～99％，位于另一個(gè)組群的兩個(gè)不同進(jìn)化分支。采用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)中國(guó)砂梨的9個(gè)樣品進(jìn)行了ACLSV分子變異分析，結(jié)果表明同源性高于98％位于同一組群的的ZY、ZSZ、HL1、

10、FS、JS1、JQ分離物的SSCP電泳為帶型一致的兩條彌散帶型，位于另一組群同源性為99％的C-XA和HL2分離物的SSCP電泳為泳動(dòng)帶型一致的兩條彌散帶型。對(duì)分離物ZY、JQ和CL多個(gè)克隆進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明，ACLSV每個(gè)分離物由不同分子變種組成，其中有一個(gè)優(yōu)勢(shì)變種；優(yōu)勢(shì)變種和非優(yōu)勢(shì)變種序列間僅幾個(gè)堿基差異，相似性高達(dá)99～100％，說(shuō)明分離物內(nèi)部存在遺傳變異，ZY和JQ兩個(gè)分離物的克隆序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果表明兩個(gè)分離物的優(yōu)勢(shì)變

11、種的序列同源性為100％。
　　 4.熱處理對(duì)梨離體植株中ACLSV和ASGV分布的影響，本研究對(duì)比組織印跡雜交的兩種化學(xué)顯色方法檢測(cè)病毒核酸產(chǎn)生的雜交信號(hào)強(qiáng)度，CDP-Star底物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)產(chǎn)生的雜交信號(hào)強(qiáng)于NBT/BCIP底物化學(xué)顯色，但信號(hào)相對(duì)較弱的NBT/BCIP底物化學(xué)顯色，既具有常規(guī)雜交技術(shù)的特異性，又可以直接觀察病毒在梨離體植株中的分布狀況，進(jìn)而采用組織印跡結(jié)合化學(xué)發(fā)光顯色法對(duì)熱處理過(guò)程中ACLSV和ASGV在砂

12、梨離體植株自莖尖到基部每隔0.5mm橫切面的動(dòng)態(tài)分布變化進(jìn)行分析，結(jié)果表明，熱處理50d后病毒濃度開(kāi)始降低，植株莖尖無(wú)病毒核酸分布，莖干中部病毒核酸也明顯下降，而莖干基部仍產(chǎn)生強(qiáng)的雜交信號(hào)，根據(jù)雜交信號(hào)的有無(wú)判斷，可以觀察到在莖尖2mm無(wú)雜交信號(hào)，表明獲得了莖尖2mm的無(wú)毒植株，對(duì)耐熱性高的ASGV病毒，在莖尖0.5mm無(wú)雜交信號(hào)，得到了莖尖0.5mm無(wú)ASGV區(qū)域，因此采用組織印跡對(duì)熱處理材料進(jìn)行病毒分布分析，直接提供熱處理50d后切

13、0.5mm和2mm莖尖繼代離體培養(yǎng)可以有效脫除ASGV和ACLSV的信息。
　　 5.熱處理誘導(dǎo)寄主基因差異表達(dá)，以37℃恒溫?zé)崽幚砗驼Ｅ囵B(yǎng)的帶有ASGV和ACLSV的黃花梨離體培養(yǎng)植株為研究體系，利用抑制差減雜交技術(shù)（SSH）構(gòu)建了熱處理誘導(dǎo)寄主上調(diào)和下調(diào)基因文庫(kù)。通過(guò)反向Southern斑點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)兩個(gè)差減文庫(kù)進(jìn)行篩選，經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序并在已知的核酸與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)文庫(kù)中共有149個(gè)unigene差異表達(dá)