我國六種雙生病毒的分子鑒定及兩種病毒的致病性研究.pdf

1、雙生病毒是植物病毒中唯一一類具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈DNA病毒,已在多個國家和地區(qū)的多種重要經(jīng)濟作物上造成毀滅性危害。自20世紀90年代起,我國的云南、廣東、廣西、海南和臺灣等地的作物及雜草上已相繼發(fā)現(xiàn)了多種雙生病毒.為進一步了解雙生病毒在我國的種類、分布及危害,本論文對我國江蘇,浙江和云南地區(qū)發(fā)生的雙生病毒進行了分子鑒定并對部分病毒進行了致病性研究。
　　 從江蘇宜興采集了2份表現(xiàn)黃花葉癥狀的苧麻樣品(J4和J5),從浙江余杭采

2、集了1份表現(xiàn)黃花葉癥狀的苧麻樣品(Z1),利用雙生病毒特異性引物PA/PB擴增得到約500 bp的DNA-A部分片段,其核苷酸序列相似性為91.6-99.2％。選擇代表性分離物J4和Z1進行全序列測定,結(jié)果顯示J4和Z1 DNA-A全長分別為2736和2737 nts(登錄號FN396969和FN396971)。利用PCR檢測到DNA-B組份,J4和Z1 DNA-B全長分別為2717和2719 nts(登錄號FN396970和FN396

3、972)。核苷酸序列比較表明,J4和Z1 DNA-A相似性為94.7％,DNA-B相似性為88.6％。J4和Z1的兩個組份都與苧麻花葉病毒(Ramie mosaic virus,RamMV)不同分離物的相似性最高,DNA-A之間的相似性為93.6-94.7％,DNA-B之間的相似性為90.6-91.2％。因此,認為J4和Z1是RamMV的兩個不同分離物。這是首次在江蘇和浙江地區(qū)報道雙組份雙生病毒。
　　 從江蘇宜興采集的表現(xiàn)黃花

4、葉癥狀的大青樣品(YX1,YX2和YX3)中分離出兩種雙生病毒。利用雙生病毒特異性引物PA/PB對3個分離物擴增的約500 bp片段的核苷酸序列相似性為59.8-99.4％,確定3個大青樣品中都存在兩種雙生病毒復合侵染。隨機選擇YX2分離物擴增兩種病毒全長基因組DNA-A,序列測定表明YX2-Ⅰ和YX2-Ⅱ全長分別為2753和2775 nts(登錄號FN396966和FN396962),它們之間的核苷酸序列相似性僅為68.2％。與其它已

5、報道的雙生病毒進行比較發(fā)現(xiàn),YX2-Ⅰ與軟枝黃嬋曲葉病毒(Allamanda leaf curl virus,AILCV)的分離物AILCV-[CN:G10:06]的相似性最高,為79.7％;YX2-Ⅱ與中國大青金色花葉病毒(Clerodendrum golden mosaic China virus,CIGMCNV)的分離物C1GMCNV-[CN:FZ7:08]的相似性最高,為93.0％。根據(jù)雙生病毒“種”的分類標準,YX2-Ⅰ是一個

6、雙生病毒新種,將其命名為江蘇大青金色花葉病毒(Clerodendrum golden mosaic Jiangsu virus,C1GMJSV);而YX2-Ⅱ為CIGMCNV的一個分離物。利用RCA-RFLP鑒定出與YX2-Ⅱ伴隨的DNA-B組份,基因組全長為2728鵬(登錄號FN396963),證實YX2-Ⅱ是一個雙組份雙生病毒。利用PCR檢測方法,未能在3個樣品中發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星分子DNAβ的存在。為進一步驗證CIGMJSV和C1GMCNV

7、的致病性,分別構(gòu)建了兩種病毒的侵染性克隆,發(fā)現(xiàn)C1GMJSV單獨接種即可在本氏煙、心葉煙、三生煙、矮牽牛和番茄上誘導典型的病害癥狀,并能和異源病毒的衛(wèi)星分子(Tobacco curly shoot betasatellite,TbCSB)在本氏煙中致病;對C1GMCNV的致病性測定表明,C1GMCNV DNA-A單獨可以系統(tǒng)侵染本氏煙、心葉煙和三生煙等寄主植物,但是其不足以誘導典型的病害癥狀,而CIGMCNV DNA-A+DNA-B混合

8、接種時能在本氏煙、心葉煙和三生煙中誘導產(chǎn)生雙生病毒侵染的典型癥狀.此外,雙組份雙生病毒C1GMCNVDNA-A能夠與TbCSB在本氏煙和心葉煙中進行功能互作。
　　 從云南寶山采集了2份表現(xiàn)為黃脈癥狀的黃花稔樣品(Y340和Y341),利用雙生病毒特異性引物PA/PB擴增得到約500 bp片段。對這些片段進行克隆和測序發(fā)現(xiàn),Y340dP存在兩種雙生病毒復合侵染(Y340-Ⅰ和Y340-Ⅱ);而Y341感染了一種雙生病毒,并且與Y

9、340-Ⅰ屬于同一類型。Y340-Ⅰ和Y341 DNA-A全長均為2750nts(登錄號FN806777和FN806778),與洋麻曲葉病毒(Kenaf leaf curl.virus,KeLCuV)不同分離物具有最高的核苷酸序列相似性,為90.5-91.0％,根據(jù)雙生病毒分類原則,Y340-Ⅰ和Y341為KeLCuV的兩個不同分離物;Y340-Ⅱ DNA-A全長為2745 nts(登錄號FN806779),其與賽葵黃脈病毒(Malva

10、strumyellow veinvirus,MaYVV)不同分離物和寶山賽葵黃脈病毒(Malvastrumyellow vein Baoshanvirus,MaYVBsV)不同分離物的核苷酸序列相似性均較高,分別為87.2-89.7％和88.5-89.2％,但系統(tǒng)關(guān)系分析表明Y340-Ⅱ與MaYVBsV的親緣關(guān)系更近,因此,將Y340-Ⅱ暫定為MaYVBsV的一個分離物。這也是首次報道KeLCuV和MaYVBsV侵染黃花稔寄主。重組分析

11、發(fā)現(xiàn),Y340-Ⅰ和Y340-Ⅱ可能是由重組產(chǎn)生的。進一步利用PCR檢測發(fā)現(xiàn),Y340和Y341樣品中都含有衛(wèi)星分子DNAI},全長分別為1342和1341 nts(登錄號FN806780和FN806781),核苷酸序列比對后發(fā)現(xiàn)均與云南賽葵黃脈病毒衛(wèi)星分子DNAβ(Malvastrumyellow vein Yunnan betasatellite,MaYVYnB)不同分離物的相似性最高,達81.7-83.4％。根據(jù)雙生病毒DNAβ種

12、的劃分標準,Y340β和Y341β屬于MaYVYnB的兩個不同分離物。在Y340樣品中還分離到了DNA1分子,Y340 DNA1全長為1370 nts(登錄號FN806782),與其它已報道的DNA1分子的核苷酸序列相似性相對較高,為61.4-82.2％,而與矮縮病毒屬病毒(nanoviruses)的相似性僅為28.4-30.0％。
　　 從采自云南瑞麗地區(qū)表現(xiàn)黃脈癥狀的銳葉牽牛樣品(Y335-338)中分離到了雙生病毒。利用雙

13、生病毒簡并引物BegoAFor1/BegoARev1對4個分離物擴增的約1.2 kb片段的相似性為97.9-99.5％。隨機選擇Y338分離物進行全序列測定(登錄號FN806776)及檢測分析,發(fā)現(xiàn)樣品中只含有單組份雙生病毒,并且與云南地區(qū)報道的甘薯卷葉病毒(Sweet potato leaf curl virus,SPLCV)分離物SPLCV-[CN:RL31:07]的相似性最高,為97.8％,因此認為Y335-338屬于SPLCV的