薔薇科植物上兩種未知病毒的基因組克隆及其分子特性分析.pdf

1、薔薇科植物是重要的園藝作物，受病毒危害后造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。明確其病毒種類是制定防治策略的基礎(chǔ)，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。近年來我們在武漢地區(qū)的玫瑰和桃上發(fā)現(xiàn)了兩種新的疑似病毒病害，對寄主具有顯著的危害性。近年來，隨著深度測序技術(shù)的快速發(fā)展，人們逐漸將該項技術(shù)運用于病毒的鑒定，可以高通量分析寄主內(nèi)的病毒種類，并可以促進(jìn)對新病毒的發(fā)現(xiàn)。本研究通過采用小RNA(smallRNA，sRNA)深度測序技術(shù)，鑒定了兩種薔薇科植物內(nèi)侵染的病毒，并發(fā)現(xiàn)了兩

2、個新病毒種。主要研究內(nèi)容包括：
　?、疟憩F(xiàn)叢簇癥狀的野薔薇植株被4種病毒復(fù)合侵染。收集表現(xiàn)小葉蓮座叢生癥狀的野薔薇樣品，利用Illumina高通量測序平臺進(jìn)行測序，通過生物信息學(xué)分析樣品中病毒的siRNA種類，深度測序的結(jié)果表明野薔薇樣品中共攜帶四種病毒。三種已報道的病毒:黑莓褪綠環(huán)斑病毒(Blackberry chloroticringspot virus，BCRV)、李屬壞死環(huán)斑病毒（Prunus necrotic rings

3、pot virus，PNRSV）、蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)和一種未知病毒，暫時命名為“玫瑰葉叢簇伴隨相關(guān)病毒”(rose leaf rosette associated virus，RLRaV)。樣品中已報道病毒可通過深度測序獲得的siRNAs組裝獲得全長基因組序列，并且與NCBI數(shù)據(jù)庫報道的病毒基因組核苷酸序列相似性很高，均在96％以上。其中ASGV為97％，BCRV為96％-97％

4、，PNRSV為97％-98％。本研究首次報道了長線性病毒屬（Closterovirus）和發(fā)狀病毒屬（Capillovirus）病毒可以侵染野薔薇。
　?、芌LRaV的基因組克隆、基因組結(jié)構(gòu)分析及與野薔薇叢簇癥狀間的相關(guān)性分析。依據(jù)siRNA拼接獲得的核苷酸序列設(shè)計引物，采用重疊延伸RT-PCR擴(kuò)增覆蓋整個基因組的片段，分別獲得5'和3'末端序列后，我們確定了RLRaV的全長核苷酸序列(登錄號為KJ748003)。RLRaV基因組

5、大小為17653個核苷酸，屬于長線性病毒科（Closteroviridae）長線性病毒屬（Closterovirus），包含13個開放閱讀框(Openreading frame，ORF)。除ORF1和五聯(lián)體基因塊區(qū)外(QGB)，其它大部分基因編碼的蛋白與已知的病毒蛋白沒有明顯相似之處，但可檢測到與一些真菌或細(xì)菌的未知蛋白具有一定相似性，并發(fā)現(xiàn)該病毒多種蛋白(L2，Mt，HSP70h和CPh)的保守區(qū)域存在插入和缺失現(xiàn)象?；诨蚪M結(jié)構(gòu)分

6、析，推測該病毒在進(jìn)化程度上較該屬其它成員高級。根據(jù)田間20多份顯癥和不顯癥樣品的檢測分析發(fā)現(xiàn)，RLRaV的侵染率較其它三種病毒侵染率高，與野薔薇的叢簇癥狀更加密切相關(guān)，因此推測RLRaV是引起野薔薇葉叢簇病害的主要病原物。
　?、潜憩F(xiàn)果實開裂的桃植株被3種病毒和2種類病毒復(fù)合侵染。利用Illumina高通量測序平臺，對表現(xiàn)果實開裂癥狀的桃植株樣品進(jìn)行測序，通過生物信息學(xué)分析樣品中病毒的vsRNA種類，深度測序結(jié)果表明桃植株樣品攜帶

7、兩種類病毒:啤酒花矮化類病毒(Hop stunt viroid, HSVd)、桃潛隱花葉類病毒(Peachlatent mosaic viroid, PLMVd)和兩種已報道病毒:蘋果褪綠葉斑病毒(Apple ChloroticLeafspot Virus，ACLSV)和李樹皮壞死環(huán)斑莖痘伴隨相關(guān)病毒(Plum bark necrosisstem pitting-associated virus，PBNSPaV)及一種未知病毒，暫時命名

8、為“桃裂果伴隨相關(guān)病毒”（Peach cracking fruit associated virus，PCFaV）。
　　⑷PCFaV的基因組克隆及基因結(jié)構(gòu)分析?；趕iRNA拼接獲得的核苷酸序列設(shè)計引物，采用重疊延伸RT-PCR擴(kuò)增、克隆測序獲得了PCFaV全長核苷酸序列。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，PCFaV與豇豆花葉病毒科（Comoviridea）蠶豆萎蔫病毒屬（Fabavirus）成員聚為一組，但與同屬病毒的遺傳距離較遠(yuǎn)。PCFaV

9、病毒基因組由兩條單鏈的RNA分子組成，RNA1和RNA2核苷酸序列分別為6309 nt和3837nt。其中，RNA1編碼一個分子量約217kDa的多聚蛋白，經(jīng)蛋白酶切割產(chǎn)生5個多肽，分別為蛋白酶輔助因子Co-pro，NTP結(jié)合域Hel，基因鏈接蛋白VPg，蛋白酶Pro和復(fù)制酶RdRp; RNA2編碼一個分子量約110kDa的多聚蛋白，被蛋白酶切割為3個功能肽，分別為與病毒運動有關(guān)的蛋白MP，復(fù)制相關(guān)的大、小外殼蛋白LCP和SCP。各基因