聚己內(nèi)酯多孔支架的表面修飾及其對內(nèi)皮細胞增殖能力的影響

1、<p>　　單位代碼 10006 </p><p>　　學 號 10101001 </p><p>　　分 類 號 Q81 </p><p><b>　　畢業(yè)設計(論文)</b></p><p>　　聚己內(nèi)酯多孔支架的表面修飾及其對內(nèi)皮細胞增殖能力的影響

2、</p><p><b>　　2014年5月</b></p><p>　院（系）名稱生物與醫(yī)學工程學院</p><p>　專業(yè)名稱生物工程</p><p>　學生姓名范 睿</p><p>　指導教師牛旭鋒</p><p><b>　　北京航空航天大學</

3、b></p><p>　　本科畢業(yè)設計（論文）任務書</p><p>　?、?、畢業(yè)設計（論文）題目：</p><p>　　聚己內(nèi)酯多孔支架的表面修飾及其對內(nèi)皮細胞增殖能力的影響。 </p><p>　?、颉厴I(yè)設計（論文）使用的原

4、始資料（數(shù)據(jù)）及設計技術(shù)要求：</p><p>　　使用的原始數(shù)據(jù)來源于相關(guān)科技文獻，其中包括了制備膠原海綿的相關(guān)內(nèi)容、聚己內(nèi)酯支架性質(zhì)研究的相關(guān)內(nèi)容、聚己內(nèi)酯支架與膠原結(jié)合的相關(guān)內(nèi)容、血管內(nèi)皮生長因子性質(zhì)檢測方法相關(guān)內(nèi)容、HUVEC細胞培養(yǎng)方法相關(guān)內(nèi)容。技術(shù)要求是制備膠原和海綿并使其附著于聚己內(nèi)酯支架內(nèi)表面（支架已存在）。 </p><p>　?、蟆厴I(yè)設計（論文）工作內(nèi)容：</p

5、><p>　　本課題研究內(nèi)容主要包括：第一部分是支架的膠原化。聚己內(nèi)酯支架并不具有生物活性，且對于生長因子的吸附性能也不盡人意。有大量的研究顯示膠原海綿經(jīng)常作為各種生長因子的載體，并且具有很好的細胞吸附性。對于支架的膠原化主要采用方法為冷凍干燥法，即通過冷凍干燥膠原懸浮液來制得。由冷凍干燥獲得的膠原海綿的孔隙結(jié)構(gòu)屬于冰晶結(jié)構(gòu)。在冷凍干燥過程中，水分的升華引起膠原聚集物分子間的交聯(lián)作用。主要造作過程為將膠原溶液或凝膠在

6、－80℃－75℃冷凍12小時，在冷凍干燥機中冷凍干燥24小時后則形成膠原海綿。在不同文獻中提到的制備膠原海綿的冷凍時間有所差別（12小時、8小時或者5小時等），冷凍干燥機的真空壓力也不盡相同。此方法步驟簡單，操作較方便，不混入化學雜質(zhì)。但是缺點是膠原海綿交聯(lián)程度一般，力學強度低。</p><p>　　第二部分是人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞在支架上的接種研究。人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)相比于癌細胞要困難很多，其要求更優(yōu)越的

7、環(huán)境以及更嚴格的無菌操作。將細胞接種在支架上需要通過預實驗確定接種數(shù)量，以及讓細胞吸附在支架上的最少時間等關(guān)鍵因素。</p><p>　　第三部分則是檢測VEGF對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖能力的影響。此實驗需要將支架上加載血管內(nèi)皮生長因子并將人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞接種于其上，培養(yǎng)一段時間通過MTS方法檢測細胞增殖情況。 　　　　　　　　　　　　

8、 Ⅳ、主要參考資料：</p><p>　　[1] Xiao C, Zhou H, Liu G, et al. Bone marrow stromal cells with a combined expression of BMP-2 and VEGF-165 enhanced bone regeneration[J]. Biomedical Materials, 2011, 6(1): 015013.<

9、/p><p>　　[2] Young S, Patel Z S, Kretlow J D, et al. Dose effect of dual delivery of vascular endothelial growth factor and bone morphogenetic protein-2 on bone regeneration in a rat critical-size defect model[

10、J]. Tissue Engineering Part A, 2009, 15(9): 2347-2362.</p><p>　　[3] Patel Z S, Young S, Tabata Y, et al. Dual delivery of an angiogenic and an osteogenic growth factor for bone regeneration in a critical siz

11、e defect model[J]. Bone, 2008, 43(5): 931-940. </p><p>　　生物與醫(yī)學工程 院（系） 生物工程 專業(yè)類 101011 班</p><p>　　學生 范

12、睿 </p><p>　　畢業(yè)設計（論文）時間：自 2014 年 1 月 8 日至 2014年 5月 31 日</p><p>　　答辯時間： 年 月 日 成績 </p><p>　　指導教師： 牛旭鋒 </p><p>　　兼職教師或答

13、疑教師（并指出所負責部分）：</p><p><b>　　無</b></p><p>　　教研室主任 </p><p>　　注：任務書應該附在已完成的畢業(yè)設計（論文）的首頁。</p><p><b>　　本人聲明</b></p><p>　

14、　我聲明，本論文及其研究工作是由本人在導師指導下獨立完成的，在完成論文時所利用的一切資料均已在參考文獻中列出。</p><p><b>　　作者：范睿</b></p><p><b>　　簽字：</b></p><p>　　時間： 2014 年 5 月</p><p>　　聚己內(nèi)酯多孔支架的表面修飾

15、及其對內(nèi)皮細胞增殖能力的影響</p><p>　　學 生：范 睿</p><p><b>　　指導教師：牛旭鋒</b></p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　在組織工程中聚己內(nèi)酯多孔支架受到了高度的關(guān)注，但是因為缺乏生物活性所以限制了其很多方面的應用。本研究的

16、目的是對聚己內(nèi)酯多孔支架進行生物功能化的修飾，并檢測其對內(nèi)皮細胞增殖能力的影響。應用冷凍干燥法制備膠原海綿，并設計支架膠原化方法使得支架內(nèi)部和表面填充膠原海綿。利用掃描電鏡對支架孔隙和外表面進行檢測，從而確定膠原化方法可行性。將50μL濃度為 0.1μg/μL的血管內(nèi)皮生長因子加載在支架上后，發(fā)現(xiàn)其可以促進內(nèi)皮細胞增殖，但是用量為50μL 0.02μg/μL的血管內(nèi)皮生長因子不能促進內(nèi)皮細胞增殖。所以此實驗結(jié)果說明聚己內(nèi)酯多孔支架在體外

17、經(jīng)膠原化并加載5μg血管內(nèi)皮生長因子后可以促進內(nèi)皮細胞增殖，證明血管內(nèi)皮生長因子仍具有生物活性，而過低濃度的生長因子則不會對內(nèi)皮細胞增殖能力產(chǎn)生影響。</p><p>　　關(guān)鍵詞：聚己內(nèi)酯多孔支架、膠原化、血管內(nèi)皮生長因子、細胞增殖</p><p>　　Bioactive functionalization of porous poly(ε-caprolactone) scaffold a

18、nd its effect on proliferation of endothelial cells</p><p>　　Author: Rui Fan</p><p>　　Tutor: Xufeng Niu</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　Poly(ε-caprolacton

19、e) (PCL) has received considerable attention in tissue engineering. However, the lack of bioactivity of PCL limits its application. The aim of this study was to functionalize the porous PCL scaffold with bioactivity and

20、to investigate its effect on the proliferation of endothelial cells (ECs). Freeze drying method was used to make collagen sponge. Scanning electron microscope (SEM) measurement demonstrated the porous PCL scaffold was su

21、ccessfully coated with collagen sponge ins</p><p>　　Key words: Poly(ε-caprolactone), collagen sponge, vascular endothelial growth factor, proliferation</p><p><b>　　1緒論</b></p>

22、<p><b>　　1.1課題背景</b></p><p>　　現(xiàn)在骨支架材料被大量的應用于實驗研究，希望應用工程設計的骨支架替代物尋求骨的再生，從而減少自體移植和同種異體移植的治療方法[1]。從現(xiàn)在的研究顯示小面積骨缺損中，利用支架材料使缺損愈合的恢復性良好，使人們對臨床骨修復充滿信心。但是大面積骨缺損的治療主要還是依賴于自體移植，骨支架并不能起到有效作用，其主要原因是大面積的

23、骨支架在移植到骨缺損部位后因營養(yǎng)供應不足導致支架部位骨生長速度緩慢并且生長后的骨會發(fā)生壞死，其次大面積的骨支架移植更容易引起生物相容性問題[2]。另外一個有前景的治療方法則是自體內(nèi)預先構(gòu)建骨支架即異位成骨，所以為了使異位成骨的骨量可以在短期內(nèi)有較好的結(jié)果，需要著重于支架的生物功能化。在支架上僅添加促骨生長因子經(jīng)動物實驗后得到結(jié)果一般，為了進一步優(yōu)化短期內(nèi)骨的生成量，則需要其它生物因子的配合。生長因子的相互配合應最大化的符合其在人體內(nèi)的生

24、理狀況，經(jīng)長期研究表明，骨組織的生長過程極其復雜，其中伴隨多種生長因子的分泌與釋放?，F(xiàn)在被大多數(shù)學者認可的是骨生長過程中血管的生長發(fā)生是必不可少的環(huán)節(jié)，血管的發(fā)生可以促進骨的生長，二者的作用相輔相成，這一點在組織工程中也漸漸受到重視[3,4]</p><p>　　圖1.1 生理骨修復過程示意圖 （a）血腫形成（在受傷后，受傷的血管組織很快形成血腫）；（b）軟骨痂的形成（在破損血管的部位會有心血管生成，也稱血管發(fā)生

25、。同時伴有外骨痂和內(nèi)骨痂的形成，形成外骨痂的過程稱為膜內(nèi)成骨，內(nèi)骨痂也稱為纖維軟骨）；（c）硬骨痂形成（骨痂進行礦化，形成編織骨的硬骨痂）；（d）骨重建（大面積的骨痂由二次板層骨代替，血管供應恢復正常）</p><p>　　在這個雙因子釋放系統(tǒng)中聚己內(nèi)酯（Poly(ε-caprolactone)，PCL）具有較高力學強度，可降解，而且容易加工成復雜的具有合理孔隙度的3D結(jié)構(gòu)。所以這種支架材料在組織工程中受到了很大

26、的關(guān)注，尤其是在骨再生方向。然而PCL并不是一個具有骨誘導能力的生物材料，這也是PCL的限制性[1]。</p><p>　　血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管內(nèi)皮細胞特異性的肝素結(jié)合生長因子，可在體內(nèi)誘導血管新生且調(diào)節(jié)血管的發(fā)展[5,6]。近期研究發(fā)現(xiàn)，此因子可以協(xié)助早期骨生長并促進支架上骨的進一步生長。受體VEGFR-2主要作用是與VEGF作

27、用后促進內(nèi)皮細胞的增值，VEGFR-1的功能研究的并不清楚，但有研究稱其可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞生長方向，向著管狀結(jié)構(gòu)發(fā)展，VEGF各個受體作用功能如圖1.2[10]。將血管內(nèi)皮生長因子加載在支架材料上可以為沒有生物活性的材料增添生物活性，在體內(nèi)移植后可以促進局部血管的生成從而輔助骨的生成。VEGF是內(nèi)皮細胞重要的促細胞分裂劑，在血管發(fā)生中其最重要的作用也是被人們研究最多的作用則是促進內(nèi)皮細胞的增值。VEGF與內(nèi)皮細胞受體VEGFR-2相互作用

28、可以影響內(nèi)皮細胞的增值能力，所以為了檢測VEGF在體外的生物活性，現(xiàn)在最常用的方法則是檢測VEGF對內(nèi)皮細胞增殖能力的影響。另外一個方法則是觀察內(nèi)皮小管的形成，因為VEGF還可以促進內(nèi)皮細胞的排布趨向，可以使其向管狀結(jié)構(gòu)發(fā)展[7-11]。</p><p>　　圖1.2 VEGF受體作用功能示意圖[10]</p><p>　　膠原海綿經(jīng)常作為各種生長因子的載體，并且具有很好的細胞吸附性，降解

29、速度較快，經(jīng)常與不具有生物活性的材料結(jié)合作為復合生物材料，并加載生長因子使材料具備一定的生物活性[12]。</p><p>　　雙因子釋放系統(tǒng)的研究并不是很廣泛，支架載體種類主要為聚己內(nèi)酯支架和聚乳酸支架，加載因子主要是促骨生長因子和促血管生長因子，研究最多的則是BMP-2和VEGF，兩種因子經(jīng)常為混合后再加載到支架上。實驗顯示，雙因子釋放系統(tǒng)中有很多因素可以影響移植后骨生成量，如運載載體的材料、生長因子的劑量比

30、和實驗檢測所用的動物模型等[12-18]。</p><p>　　此雙因子釋放系統(tǒng)應用于異位成骨研究，在后續(xù)實驗中會將其植入到小鼠皮下組織對骨生成量進行觀察，從而確定VEGF與BMP-2相結(jié)合是否會在短期內(nèi)增加骨的生成量。如若骨量有較明顯的變化則會進一步對雙因子釋放系統(tǒng)進行體外細胞實驗以進一步研究雙因子釋放系統(tǒng)的作用機制。</p><p>　　1.2研究目的和意義</p>&l

31、t;p>　　以上述研究背景為基礎(chǔ)，整體實驗目的為設計雙因子釋放系統(tǒng)以促進異位早期骨生成量。設計分為兩大部分，體外和體內(nèi)實驗。體外實驗主要包括對兩種生長因子的結(jié)合釋放動力學的研究以及兩種生長因子分別在支架上生物活性的檢測。體內(nèi)實驗主要包括檢測雙因子釋放系統(tǒng)植入到小鼠皮下4-8周后的骨生成量、血管生長情況、以及軟骨生長情況，并與單因子釋放的支架相比較這些指標。簡要實驗設計圖如下所示：</p><p>　　表1.

32、1 整體實驗設計</p><p>　　我的畢設實驗是此實驗中的一部分（字體加粗部分）。將VEGF加載到空白支架上后需要檢測其是否還具有生物活性，若其仍具有生物活性那么在體內(nèi)實驗中獲得的實驗數(shù)據(jù)才是有參考價值的。判斷VEGF的生物活性需要檢測幾個指標，而檢測其對內(nèi)皮細胞增殖能力的影響是最常用也最有說服力的檢測方法。所以我畢設的實驗目的就是對PCL支架表面功能化，并檢測其對內(nèi)皮細胞增殖能力的影響。</p>

33、<p>　　1.3國內(nèi)外研究狀況</p><p>　　針對雙因子釋放系統(tǒng)和本實驗所涉及的實驗方法，我對進幾年左右的文獻進行了整理，并總結(jié)如下。</p><p>　　1.3.1雙因子釋放系統(tǒng)的研究</p><p>　　現(xiàn)在每年有超過6.2×106的骨折病例產(chǎn)生，這其中有5-10%的病例中的患者會在治療過程中因為治療方法不當或不及時最后導致骨折不

34、愈合。如果現(xiàn)在不找出一個有效的方法來解決這種現(xiàn)狀，患者們的殘疾率將會大大提升，而他們的生活質(zhì)量也會降低很多。骨是高度血管化的組織并且血管發(fā)生對骨再生非常重要，因為血管可以運輸養(yǎng)分和廢物，為骨的生長提供支持。骨中血管不足會導致骨形成和骨量的下降。新血管的形成在骨修復過程中會為骨髓間充質(zhì)干細胞和成骨細胞提供營養(yǎng)，而且實驗研究發(fā)現(xiàn)在一些骨折模型中血管發(fā)生可以促進骨的發(fā)生和生長。所以解決骨再生過程中血管發(fā)生問題是很重要的[19]。</p&

35、gt;<p>　　血管生成和骨生成這兩種因子的可控制的釋放系統(tǒng)可以模擬生物體內(nèi)骨修復過程，VEGF是一種重要的促血管生長因子，在骨修復中的膜內(nèi)和軟骨內(nèi)成骨都有很重要的作用。BMP-2是促骨生長因子，在異位和原位成骨的應用都很廣泛。經(jīng)調(diào)研文獻它曾被用在大鼠，兔子和狗的骨折位置和缺陷處以檢測其對骨生成的影響。大部分雙因子釋放系統(tǒng)的實驗是在動物體內(nèi)進行的，研究此系統(tǒng)在原位骨生成中的作用，使用的動物模型多為臨界缺陷（critica

36、l size defects， CSDs）骨折模型。CSDs是一種臨界體積的骨缺陷，當骨達到這種缺陷的尺寸后，其再生時不能通過自我調(diào)節(jié)生成足夠的骨量而彌補缺陷的距離。大部分實驗結(jié)果顯示雙因子釋放系統(tǒng)相比較于單因子的應用可以促進一定時間內(nèi)骨的生成，進一步研究稱雙因子釋放系統(tǒng)的作用在于骨修復的早期，所以雙因子釋放系統(tǒng)可以促進骨修復的速度。Z.S. Patel et al.[19]的實驗評價了其設計的雙因子釋放系統(tǒng)。VEGF和BMP-2加載到

37、具有明膠微顆粒的聚丙烯酰胺[poly(propylene fumarate),PPF]多孔支架上以制得雙因子釋放系統(tǒng)，檢測其在8mm臨界大鼠顱骨缺損模型</p><p>　　對于雙因子釋放系統(tǒng)還有少量關(guān)于劑量對于作用程度的研究。在Young et al.[20]實驗研究中假設雙因子釋放系統(tǒng)中BMP-2的劑量減少會導致骨量生成的減少，而這種下降會因為提升VEGF的劑量而得到抑制。在8mm臨界大鼠顱骨缺損模型上進行動

38、物實驗，發(fā)現(xiàn)BMP-2相比較于VEGF可以更持續(xù)的釋放。降低BMP-2的含量會降低最終骨的生成量，但是增加VEGF的含量并不能抑制這一趨勢。在Hernandez et al.[21]的實驗中也進行了相關(guān)雙因子釋放系統(tǒng)劑量的研究。此實驗在聚乳酸微球上面加載VEGF（0.35μg和1.75μg）和BMP-2（3.5μg和17.5μg），再將微球加載到聚乳酸支架上，將其植入到兔子的股骨處進行原位成骨研究。這樣設計的目的是想要控制不同劑量的生長

39、因子的釋放并保持生長因子釋放部位始終在缺損部位。在第4周的時候后幾乎沒有發(fā)現(xiàn)不同劑量間兩種因子的配合有什么特別的作用，在第12周實驗結(jié)果顯示兩種因子的配合并沒有起到什么明顯作用。說明進一步實驗應該優(yōu)化VEGF的劑量、兩種因子的釋放順序以及兩種因子的劑量比以達到更好的雙因子釋放系統(tǒng)的效果以促進骨的再生。</p><p>　　對于雙因子釋放系統(tǒng)在動物體內(nèi)對于異位成骨影響的研究也有涉及。主要結(jié)論有之前Kakudo et

40、 al.[22]的研究，將VEGF和BMP-2加載在膠原水凝膠中，使其在異位成骨部位釋放（老鼠的小腿肌肉）。證實了雙因子釋放系統(tǒng)的實驗組在第3周時毛細血管密度和骨生成量比只有單因子BMP-2存在的血管密度和骨生成量要多。</p><p>　　骨再生是一個受到調(diào)節(jié)的級聯(lián)反應，由多種細胞因子和生長因子所控制。血管生長因子是在骨修復過程早期為了重建血管系統(tǒng)被表達的，與此同時促骨生長因子在骨形成和重塑過程中一直持續(xù)表達著

41、。D.H.R. Kempen et al.[23]的實驗目的是探究若將促血管生長因子VEGF和促骨生長因子BMP-2有順序的釋放，是否能促進骨的生成（相比較于只釋放BMP-2的系統(tǒng)）。實驗將各實驗組植入到大鼠體內(nèi)（包括異位成骨和原位成骨的研究）。經(jīng)檢測復合物在前三天VEGF會大量釋放，BMP-2連續(xù)56天持續(xù)釋放。盡管VEGF并沒有達到促進骨生成的目的但是在異位成骨的移植中其促進了血管網(wǎng)絡的形成。在原位移植的實驗組中并沒有發(fā)現(xiàn)血管和骨量

42、的增加（兩類實驗都是與單獨存在BMP-2的試驗組相比較）。</p><p>　　對于雙因子釋放系統(tǒng)的構(gòu)建方法在一些文獻中也有所提及。Z.S. Patel et al.[19]實驗中構(gòu)建的復合支架包括明膠微顆粒和多孔聚丙烯酰胺[poly(propylene fumarate),PPF]支架。在明膠微顆粒上分別吸附定量的VEGF或者BMP-2，按照實驗設計的定量和比例將加載有不同生長因子的明膠顆?；旌喜⒓虞d到支架上，

43、對照組中明膠顆粒吸附的是PBS。在C Xiao et al.[24]的研究中，在天然珊瑚支架上加載雙因子，加載方法是將VEGF和BMP-2的基因轉(zhuǎn)染到兔子的骨髓基質(zhì)干細胞中，再將轉(zhuǎn)染后的骨髓基質(zhì)干細胞加載在支架上。最后將支架植入到兔子的臨界骨缺損部位進而觀察雙因子釋放系統(tǒng)的作用。D.H.R. Kempen et al.[23]實驗中的設計更加精細，因為將兩種因子分別分布在復合支架的不同空間上以達到兩種因子不同釋放速度的目的。復合物包括聚

44、乳酸微球，微球上面加載BMP-2，后將微球加載在聚丙烯支架上，聚丙烯支架周圍包裹加載了VEGF的明膠水凝膠，這個復合物可以達到讓兩個因子不同速度釋放的目的，VEGF首先快速釋放而BMP-2緩慢長期釋放，如圖1.3。</p><p>　　圖1.3復合支架示意圖。明膠水凝膠和PPF支架兩個部分在移植進入動物體內(nèi)前復合到一起。</p><p>　　通過以上實驗設計，方法和結(jié)果的總結(jié)可知現(xiàn)在雙因子

45、釋放系統(tǒng)的研究還遠遠不足，其作用的結(jié)果受多種因素影響，如兩種因子的劑量比、加載方式、釋放順序以及實驗應用的動物模型。所以進一步實驗應該尋找雙因子釋放系統(tǒng)的共性并結(jié)合劑量變化進一步研究。通過現(xiàn)象對雙因子釋放系統(tǒng)進行機制上的研究也是必不可少的一部分。</p><p>　　1.3.2制作膠原海綿</p><p>　　制作膠原海綿的過程中首先需要純化膠原材料，將其溶解于酸堿度合適的水溶液或者懸浮液

46、中（此步驟對于膠原纖維的溶脹程度和纖維結(jié)構(gòu)的水解程度有很大影響）。接下來經(jīng)過一系列操作使膠原溶液轉(zhuǎn)變?yōu)槟z原海綿，在這些方法中，最基本的就是冷凍干燥法。另外還有兩種方法化學交聯(lián)和物理交聯(lián)可以對膠原進行交聯(lián)并且相比較于冷凍干燥法這兩種方法可以進一步加強膠原交聯(lián)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[25]。</p><p><b>　?。?）冷凍干燥法</b></p><p>　　膠原海綿可以通過

47、冷凍干燥膠原懸浮液來制得。由冷凍干燥獲得的膠原海綿的孔隙結(jié)構(gòu)屬于冰晶結(jié)構(gòu)。其原因是在冷凍干燥過程中，水分的升華引起膠原聚集物從而產(chǎn)生分子間的交聯(lián)作用[26]。</p><p>　　主要操作過程為將膠原溶液或凝膠在－80℃至75℃冷凍12小時左右使膠原中的水分完全結(jié)成冰晶，在冷凍干燥機中冷凍干燥24小時后水分升華，則形成膠原海綿。在不同文獻中提到的制備膠原海綿的冷凍時間有所差別（12小時、8小時或者5小時等）[27

48、-30]，冷凍干燥機的真空壓力也不相同，但是根據(jù)樣品容量進行適當?shù)恼{(diào)整，只要符合原理即可以成功制備膠原海綿[31,32]。</p><p><b>　?。?）化學交聯(lián)法</b></p><p>　　化學交聯(lián)物包括醛、酰基疊氮、碳化二亞胺、聚環(huán)氧樹脂復合物等，比如戊二醛就是現(xiàn)在是用途很廣泛的一種醛類交聯(lián)劑。不同的交聯(lián)劑的交聯(lián)原理不同，結(jié)構(gòu)的改變形式也不同，所以使用不同的

49、交聯(lián)劑使得膠原海綿結(jié)構(gòu)穩(wěn)定程度不同，使得穩(wěn)定程度由小到大的試劑順序是：氨腈<二氯乙烷<六亞甲基氨基甲酸二胺<聯(lián)氨<二苯基磷酰基疊氮化物<戊二醛[33]。</p><p>　　經(jīng)總結(jié)文獻，以戊二醛為例主要有兩種操作方法。其一主要操作過程為：將膠原支架放入100ml 含有0.02%或者0.2%戊二醛的0.05M的醋酸溶液中，實驗條件為4℃，24小時，之后將處理的膠原海綿放在50mM甘氨酸

50、水溶液中，保持溫度37℃，浸泡1小時以阻斷未反應的戊二醛醛基[34]。</p><p>　　另一種較常用的方法是將膠原海綿用戊二醛蒸氣處理，戊二醛蒸汽是由飽和的25%戊二醛溶液制得，將膠原海綿與蒸汽在37℃下反應4小時。交聯(lián)后，用0.1M甘氨酸水溶液處理海綿阻斷未反應的戊二醛醛基[29,30]。</p><p>　　以上兩個實驗的戊二醛化學交聯(lián)過程是比較有代表性的，所使用的實際濃度應根據(jù)實

51、際實驗目的和設計進一步設定。</p><p><b>　　（3）物理交聯(lián)法</b></p><p>　　物理交聯(lián)的方法主要包括干熱交聯(lián)處理，紫外線照射和γ射線照射[25]。</p><p>　　最常用的方式是干熱交聯(lián)處理。在處理后用70%乙醇或者環(huán)氧乙烷對膠原海綿進行殺菌處理。</p><p>　　物理交聯(lián)方法應注意的是

52、對生物大分子活性的影響，因為在經(jīng)過干熱，紫外或者射線處理后大部分生物大分子已經(jīng)變性，如膠原溶液在長時間紫外照射后不能再進行交聯(lián)，所以應該在考慮實驗設計的前提下慎重使用物理交聯(lián)方法[29,30,35]。</p><p>　　1.3.3膠原海綿/凝膠和VEGF</p><p>　　因為本實驗涉及將VEGF加載在膠原海綿上的實驗步驟，所以總結(jié)近期研究，主要有三種膠原與VEGF結(jié)合的方式，包括吸附

53、，共價連接與混合。</p><p><b>　?。?）吸附法</b></p><p>　　VEGF溶液可吸附在冷凍干燥后的膠原海綿上，如果VEGF水溶液的容量沒有超過膠原海綿的最大吸水量，那么其可以完全被冷凍干燥的膠原海綿所吸收。此方法利用膠原海綿吸水性的特征，優(yōu)點是簡單易行，缺點是不易定量控制VEGF的加載量[34]。</p><p>　　在

54、Kampmann A et al.[36]的實驗中，在有膠原覆蓋的聚乳酸支架上加載VEGF的步驟是將鼠科VEGF164溶于2μl含有1%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液中。將此溶液逐滴滴到支架上，并在空氣中干燥16－18小時。</p><p><b>　?。?）共價交聯(lián)法</b></p><p>　　共價交聯(lián)法則是利用共價鍵將VEGF與膠原海綿相連接，VEGF在膠原海綿上穩(wěn)

55、定性較好，其釋放的速度也可以等到較好的控制，但是實驗引入了不同交聯(lián)劑[37,38]。</p><p>　　在Miyagi Y et al.[37]的實驗中，支架浸泡于含有二氯乙烷和N-羥基硫代琥珀酰亞胺的磷酸鹽緩沖液中20分鐘，后將支架在VEGF溶液中浸泡2小時已達成共價交聯(lián)。</p><p><b>　　（3）混合法</b></p><p>

56、　　混合法則指的是膠原溶液于VEGF溶液的混合，即在制備出膠原海綿的同時VEGF就已經(jīng)存在于膠原海綿中了，此方法可以使得VEGF分布較為平均，但是制備過程需要嚴格控制條件避免VEGF的失活。</p><p>　　在Singh S et al.[39]實驗中體現(xiàn)了混合法的操作過程如下：將人源VEGF165溶液加入到中性膠原溶液中，之后將提前浸濕過的支架浸泡在混合液中，保持環(huán)境為4℃，過夜。取出支架后空氣干燥則得到了

57、表面加載有膠原-VEGF的復合支架。</p><p>　?。?）膠原凝膠和VEGF</p><p>　　應用較多的膠原的狀態(tài)有海綿或者凝膠，在一些實驗中應用膠原凝膠作為VEGF的載體，膠原凝膠飽含水分適合細胞的吸附與生長，但是膠原凝膠不易定型。</p><p>　　在I. d’Angelo et al.[40]實驗中，使膠原凝膠具有VEGF活性的過程如下，首先將VE

58、GF溶液加入到未交聯(lián)的膠原溶液中（VEGF的最終濃度是70ng/ml），之后將膠原溶液放入環(huán)境為37℃的溫箱中，24小時后獲得混合有VEGF的膠原凝膠。</p><p>　　1.3.4具有膠原覆蓋的PCL支架和聚乳酸支架</p><p>　?。?）膠原與聚乳酸支架結(jié)合法</p><p>　　很多實驗是將聚乳酸支架與膠原相結(jié)合，這個復合物既具備合成高分子的力學強度，又

59、具備膠原海綿上生物因子所帶來的生物活性[28]。</p><p>　　在A. Kampmann et al.[36]實驗中兩者相結(jié)合的實驗過程為：將具有特定結(jié)構(gòu)的聚乳酸支架系在線上，將其在含有0.2%一型鼠尾膠原溶液中浸泡1分鐘，后在空氣中干燥1小時。此過程重復一遍。之后將覆蓋有膠原的支架用PBS清洗1小時并在空氣中干燥。將其保存在4℃條件下以備使用。</p><p>　?。?）膠原與PC

60、L支架結(jié)合法</p><p>　　膠原與PCL支架相結(jié)合也是很多實驗的研究重點。其中有一個實驗所提到的結(jié)合方法是：將膠原（0.5μM）和PCL（溶解在冰醋酸中）相互混合并調(diào)節(jié)酸堿度到4.2，混合的摩爾比分別為1：1，1：2，1：3和1：4，在4℃下不斷攪拌。用掃描電鏡觀察所制成復合物的形貌特征[41]。</p><p>　　1.3.5 VEGF體外生物活性檢測</p><

61、;p>　　經(jīng)文獻總結(jié)對于體外檢測VEGF生物活性的方法主要有兩種，其一是檢測其對內(nèi)皮細胞增殖能力的影響，其二是檢測其是否能趨使內(nèi)皮細胞形成內(nèi)皮細胞小管。</p><p>　　聚乳酸/聚乙二醇微球可以作為生物活性因子的載體，并且此載體可以在一定程度上控制生物因子的釋放，在組織工程中收到重視。在King, T.W et al.[42]的實驗中VEGF作為促血管生成因子被加載到聚乳酸/聚乙二醇微球復合體系中。實驗

62、中檢測了VEGF的加載效率、釋放動力學，還有體外人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖，用以檢測此復合支架上VEGF的生物活性。經(jīng)檢測結(jié)果顯示一定量的存在于微球上的VEGF可以促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖，說明體外加載在支架上的VEGF具有生物活性。</p><p>　　同樣在Richardson, T.P et al.[43]的實驗中，在一種聚酯支架上添加兩種具有不同釋放動力學的因子，血管內(nèi)皮生長因子和血小板衍生生長因子。兩種因

63、子分別在體外進行生物活性檢測，檢測血小板衍生生長因子加載后的生物活性應用平滑肌細胞增值檢測，檢測血管內(nèi)皮生長因子加載后的生物活性應用的方法是內(nèi)皮細胞的增殖能力檢測。</p><p>　　同時還有一種廣泛應用的方法用于檢測VEGF在體外的生物活性，即內(nèi)皮小管形成的實驗。在J.M. Kanczler et al.[44]的實驗中將VEGF利用超臨界二氧化碳萃取的方法加載到多孔聚乳酸支架上。為了檢測利用超臨界二氧化碳萃

64、取處理的VEGF是否還具有生物活性，實驗應用人工基底膜管形成分析法進行檢測，即在人工基底膜上接種內(nèi)皮細胞，膜上含有經(jīng)超臨界二氧化碳萃取處理的VEGF。經(jīng)過16小時細胞培養(yǎng)培養(yǎng)，利用蔡司倒置顯微鏡觀察膜管長度以及網(wǎng)絡的形成。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理VEGF可以使內(nèi)皮細胞興成小管類似的形狀說明VEGF仍具有生物活性，內(nèi)皮細胞小管形成見圖1.4</p><p>　　圖1.4 內(nèi)皮小管形成圖。A是不加入VEGF的顯微鏡下內(nèi)皮細

65、胞觀察圖；B是加入VEGF的顯微鏡下內(nèi)皮小管觀察圖；C是經(jīng)加入超臨界二氧化碳萃取處理的VEGF的內(nèi)皮小管的顯微鏡下圖；D是對三組內(nèi)皮小管長度的數(shù)據(jù)統(tǒng)計；E是三組內(nèi)皮小管網(wǎng)絡的數(shù)據(jù)統(tǒng)計</p><p>　　2聚己內(nèi)酯多孔支架的表面修飾</p><p><b>　　2.1前言</b></p><p>　　聚己內(nèi)酯（Poly(ε-caprolacto

66、ne)，PCL）具有較高力學強度，可降解，而且容易加工成復雜的具有合理孔隙度的3D結(jié)構(gòu)。所以這種支架材料在組織工程中受到了很大的關(guān)注，尤其是在骨再生方向。然而PCL并不是一個具有骨誘導能力的生物材料，這也是PCL的限制性。所以對支架進行生物功能化有很重要的意義。在此實驗中，應用的聚己內(nèi)酯多孔支架是一個長寬高分別為6.3mm×6.3mm×4mm的多孔支架，如圖2.1。為了達到令VEGF快速釋放的目的，實驗將支架膠原化并

67、應用膠原海綿作為VEGF的載體，通過文件調(diào)研已知膠原海綿在體內(nèi)的降解時間為1-2周，而PCL的降解時間長達1年左右。</p><p>　　血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管內(nèi)皮細胞特異性的肝素結(jié)合生長因子，可在體內(nèi)誘導血管新生且調(diào)節(jié)血管的發(fā)展，血管的生長可以促進骨的生長。利用VEGF對聚己內(nèi)酯多孔支架進行生物功能化并且希望此生長因子可以從支架上

68、較快速的釋放的實驗過程設計是本實驗的一個創(chuàng)新點，這個過程考慮了整體實驗的實驗目的和設計，還有應用過程的實用性和簡便性，第二部分則是檢測生長因子在支架上生物活性的實驗。</p><p>　　圖2.1 聚己內(nèi)酯多孔支架示意圖。（a）實驗所用支架的結(jié)構(gòu)圖；（b）實驗所用支架的實物圖</p><p><b>　　2.2實驗部分</b></p><p>

69、<b>　　2.2.1試劑材料</b></p><p>　　聚己內(nèi)酯多孔支架，鼠尾一型膠原蛋白（8.97mg/ml）,Sylgard@184硅橡膠，10×PBS，1M NaOH，超純水等試劑。</p><p>　　2.2.2支架表面修飾方法</p><p>　　1、制備硅膠模具。將兩種試劑按比例10：1混合后倒入容器內(nèi)，除去氣泡后將與

70、支架結(jié)構(gòu)相契合的PCL圓柱體插入液體中，固定好后一并放入烤箱，將烤箱溫度調(diào)整到50℃并維持8小時。取出盛有模具的容器放在丙酮中浸泡8小時，目的是將外部塑料溶解，后取出模具。將模具放入70%乙醇中再浸泡8小時進行消毒，取出后空氣干燥。模具如圖2.2。</p><p>　　圖2.2 Sylgard@184硅橡膠模具實物圖</p><p>　　2、根據(jù)膠原溶液使用說明書配置1.05ml 5mg/

71、ml的膠原中性稀釋液。</p><p>　　配置膠原中性稀釋液過程中各個試劑添加順序及計算公式如下：</p><p>　?。?）首先確定所需制備的膠原中性稀釋液的體積（V）和濃度（C）</p><p>　?。?）加入V1體積的10╳PBS，計算公式：ml </p><p>　?。?）計算實際所需膠原原溶液的體積V2，計算公式：</p&g

72、t;<p>　?。?）計算所需1M NaOH體積V3，計算公式：V2×0.023ml=V3</p><p>　?。?）計算所需超純水的體積V4，計算公式：V-V1-V2-V3=V4</p><p>　?。?）將上述體積的各種溶液混合在一起，注意最后添加膠原原溶液，并混合均勻</p><p>　　針對本實驗具體配置步驟如下：</p>

73、<p>　?。?）首先取105μl 10×PBS溶液放入容器中</p><p>　?。?）加入13μl 1M NaOH 溶液</p><p>　?。?）加入347μl 超純水</p><p>　　（4）加入585μl 8.97mg/ml 膠原溶液</p><p>　?。?）混合均勻，放置在低溫環(huán)境保存以免快速成膠<

74、;/p><p>　　3、用1×PBS浸泡支架2分鐘，取出支架后將其放入模具中。</p><p>　　4、并向支架中分別注射70，80，90μl膠原中性稀釋液。</p><p>　　5、將模具放入37℃溫箱30分鐘，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱8小時，再放入冷凍干燥機24小時，取出后用鑷子將支架取出即獲得膠原化的聚己內(nèi)酯多孔支架。</p><p>

75、　　6、分別配置0.02和0.1μg/μl濃度的VEGF溶液，分別滴注50μl兩種濃度的VEGF溶液在支架上即完成支架表面的修飾。 </p><p>　　2.2.3實驗測試儀器</p><p>　　掃描電鏡：將膠原化后的支架表面磨平，噴金后進行JEOL掃描電鏡不同區(qū)域的檢測，加速電壓分別為是10kV和20kV。</p><p><b>　　2.3結(jié)果與討論

76、</b></p><p>　　在本階段實驗中的主要實驗目的是對支架進行膠原化。實驗中利用冷凍干燥法使支架表面和內(nèi)部形成膠原海綿，通過掃描電鏡對膠原化后的支架表面進行觀察，沒有對支架膠原化的優(yōu)劣進行過多詳細的檢測評價。</p><p>　　此階段實驗中要分為兩部分，第一部分是掌握膠原海綿的制備方法并確定配置膠原中性稀釋液的濃度。膠原海綿的制備方法較多，其中包括冷凍干燥法、化學交聯(lián)

77、法和干熱交聯(lián)法等等。選擇冷凍干燥法的原因有二，其一是此制備方法不可以對支架上已存在的BMP-2的生物活性造成影響（注意，此實驗中因為實驗主要目的并不是研究兩種因子相互作用所以支架在膠原化之前并沒有吸附BMP-2，但是后面的動物體內(nèi)實驗中雙因子釋放系統(tǒng)的制備流程是：吸附BMP-2，膠原化，吸收VEGF，植入動物體內(nèi)，所以膠原化過程后必須保證BMP-2生物活性依然存在）；其二是盡量選擇簡單易行的實驗方法，并對體內(nèi)試驗不造成影響。冷凍干燥法主

78、要包括三個階段，37℃成膠，-80℃冷凍，-55℃冷凍干燥，經(jīng)調(diào)查文獻不同實驗中此方法每個階段的溫度條件幾乎一致，但是時間條件不盡相同。所以根據(jù)文獻參考制定了每個階段的最優(yōu)時間段，在實驗中選擇最優(yōu)時間段中最小的時間限度進行制備并檢測BMP-2生物活性情況，最后得出實驗方法為37℃成膠30分鐘，-80℃冷凍8小時，-55℃冷凍干燥24小時。</p><p>　　確定實驗方法后進一步對膠原中性稀釋液的濃度進行選擇。分

79、別設定了三種濃度0.3mg/ml、1mg/ml、5mg/ml，經(jīng)冷凍干燥法分別制備1ml液體體積的膠原海綿（容器為1.5ml EP管）?？煞浅Ｃ黠@觀察到相同體積的液體制備出不同體積的膠原海綿，濃度越小制備出的膠原海綿收縮越嚴重。并且從實物圖可以看出0.3mg/ml的膠原海綿只可觀察到少量的纖維，另外一部分為粉末狀；1mg/ml 的膠原海綿纖維膠細，柔軟；5mg/ml的膠原海綿結(jié)構(gòu)較完整，收縮程度最小，如圖2.2。</p>

80、<p>　　圖2.3 三中濃度的膠原海綿實物圖</p><p>　　此階段試驗的第二部分就是在應用冷凍干燥法制備膠原海綿的基礎(chǔ)上對支架進行膠原化，實驗主要目的是對支架內(nèi)部填充膠原海綿以作為VEGF的載體。支架膠原化的方法使用的較多的為反復浸泡-干燥法，填充法，還有將液體高分子（支架材料）與膠原混合后進行支架制備的方法。實驗選擇填充法的原因有兩個，其一是希望膠原海綿較多的形成于支架內(nèi)部，同時在支架表面也有

81、覆蓋，這樣可以增加每個支架攜帶海綿的體積，有助于吸收生長因子溶液。經(jīng)調(diào)研文獻發(fā)現(xiàn)因為膠原溶液在干燥后會發(fā)生一定的萎縮，所以反復的浸泡-干燥對于膠原內(nèi)部海綿的形成不利，其可以在支架表面形成海綿。直接混合法從實驗源頭改變的實驗條件與本實驗目的不符合。填充法向模具中的支架內(nèi)部填充足量的體積溶液，溶液在制備過程中不會流出；其二是填充法中各個變量容易控制，如注射液體積，操作過程適用于較多樣本且方便操作。</p><p>　

82、　支架膠原化實驗中根據(jù)支架的幾何模型計算出內(nèi)部空間理論體積，根據(jù)此體積設計了三個注射量體積70、80、90μl進行實驗。實驗過程中注意兩點，第一，因支架表面疏水，所以為了提高膠原溶液在支架內(nèi)部的填充體積應對支架進行浸泡濕潤；第二，利用真空泵將膠原溶液中的氣泡抽出。實驗結(jié)果顯示三種注射量的支架內(nèi)部均有膠原海綿的填充，表面也都有膠原海綿的覆蓋。注射量為90μl制得的膠原化支架可明顯看出支架外部有大量溢出剩余海綿，所以判斷為注射量過大。注射量

83、為70μl和80μl的支架經(jīng)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，注射量為70μl的支架空隙中膠原纖維形狀較長較大，纖維分布不密集，有明顯空白區(qū)域，如圖2.4B。而在支架的外表面可以看到只有部分覆蓋了成纖維狀的膠原海綿，還有部分表面呈不規(guī)則顆粒狀，其為未被膠原畫面覆蓋的PCL支架表面，如圖2.4D；注射量為80μl的支架空隙中膠原海綿纖維密集，填充情況較好，如圖2.4A。在支架外表面幾乎全部覆蓋上了膠原海綿觀察不到成顆粒狀的PCL支架表面，如圖2.4C。所

84、以在最終膠原化的方法中選擇80μl的注射量進行實驗。</p><p>　　圖2.4 膠原化后支架的掃描電鏡圖。（A）向支架中注射膠原中性稀釋液80μl 后制備成的支架孔洞處掃描圖；（B）向支架中注射膠原中性稀釋液70μl 后制備成的支架孔洞處掃描圖；（C）向支架中注射膠原中性稀釋液80μl 后制備成的支架外表面掃描圖；（D）向支架中注射膠原中性稀釋液70μl 后制備成的支架外表面掃描圖。</p>&

85、lt;p>　　3表面修飾的聚己內(nèi)酯支架對內(nèi)皮細胞增殖能力影響的檢測</p><p><b>　　3.1前言</b></p><p>　　向膠原化的支架上加載VEGF后檢測其是否對內(nèi)皮細胞增殖能力有影響的主要目的是確定體外固定在支架上的VEGF是否還存在生物活性。對支架進行生物活性的修飾現(xiàn)在在組織工程中收到了很大的重視，生物因子與沒有生物活性的高分子支架相結(jié)合的方

86、式主要有化學連接，物理吸附等等。在生物因子加載到支架上后會產(chǎn)生與高分子支架的相互作用，主要有共價鍵的變換，離子鍵以及氫鍵的變換， 這些變換很有可能變換生物因子的結(jié)構(gòu)甚至使其失活。所以在體外的生物大分子支架的生物功能修飾后生物因子的活性檢測必不可少。血管內(nèi)皮生長因子對內(nèi)皮細胞增值能力的促進是廣為研究者們熟知的，根據(jù)研究顯示VEGF在具有活性的情況下會與內(nèi)皮細胞表面的VEGFR-2號受體相結(jié)合，產(chǎn)生促進內(nèi)皮細胞增殖的作用。同時利用內(nèi)皮細胞增

87、值能力的檢測方法是檢測體外VEGF是否具有生物活性的普遍方法。</p><p>　　對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖能力的檢測主要應用的是MTS染色法。[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium] (MTS)是一種用比色法來檢測細胞增殖和細胞毒實驗中的活細胞數(shù)量的檢測試劑。MTS 被細胞生

88、物還原成為一種有色的甲臜產(chǎn)物，可直接溶解于培養(yǎng)基中。這種轉(zhuǎn)化很可能是在代謝活躍的細胞中的脫氫酶產(chǎn)生的NADPH或NADH的作用下完成的。在490nm處檢測到的甲臜產(chǎn)物的量與培養(yǎng)中的活細胞數(shù)成正比，所以應用這種方法可以快捷的檢測活細胞數(shù)量。</p><p>　　3.2實驗試劑與材料</p><p>　　0.05%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸，胎牛血清，細胞培養(yǎng)基（高糖），1×HBSS，臍

89、靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基，MTS檢測試劑。</p><p><b>　　3.3實驗方法</b></p><p>　　3.3.1人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)</p><p>　　（1）向75cm2細胞培養(yǎng)瓶中添加水浴溫熱好的15ml細胞培養(yǎng)基，放入細胞培養(yǎng)箱中30min。</p><p>　?。?）將一瓶含有5×105細胞的

90、冷凍管從液氮中取出后水浴溫熱（不超過2分鐘），將所有細胞液吸出加入到培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放入細胞培養(yǎng)箱。</p><p>　?。?）24小時后觀察細胞是否貼壁，若細胞已經(jīng)貼壁則進行換液，培養(yǎng)基體積15ml。</p><p>　?。?）每48小時換一次培養(yǎng)基，當細胞覆蓋率達到80%以上進行細胞傳代。</p><p>　?。?）收獲細胞時將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基吸出，加入15ml

91、 1×HBSS清洗兩次。</p><p>　　（6）加入6ml胰蛋白酶/乙二胺四乙酸，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱等待5分鐘后，顯微鏡觀察，若有90%細胞已經(jīng)漂浮則說明可以進行下一步。</p><p>　?。?）加入9ml終止胰酶反應液，對培養(yǎng)瓶底部輕輕吹打，吸出細胞液并進行離心（1100rpm，5min）。</p><p>　　（8）將細胞重新懸浮在5ml培養(yǎng)基中

92、，進行細胞計數(shù)。</p><p>　　（9）進行細胞實驗、傳代或冷凍。</p><p>　　3.3.2內(nèi)皮細胞增殖能力的檢測</p><p>　?。?）細胞計數(shù)后經(jīng)計算取出細胞數(shù)為9×104，1.8×105，12.7×105，3.6×105對應的細胞液體積，分別補足細胞培養(yǎng)基至1.5ml。將四份細胞液混勻分別分三份加入到48孔

93、板中（每孔加入500μl），將孔板放入細胞培養(yǎng)基放置1小時。</p><p>　?。?）取出后每孔加入100μlMTS檢測試劑，將孔板放入培養(yǎng)基放置4小時。</p><p>　?。?）取出后每孔取3個樣分別為100μl，加入到96孔板中再放入酶標儀。</p><p>　?。?）波長在490nm處檢測各個樣品吸光度，做標準曲線。</p><p>

94、;　?。?）確保膠原化后的支架無菌干燥，將其放入防止細胞吸附的24孔板中。如第二章實驗步驟所述將VEGF溶液滴注在支架上后，維持20分鐘后滴加50μl細胞培養(yǎng)基，維持25分鐘。</p><p>　?。?）將細胞數(shù)為4×104對應的細胞液體積滴加在支架上，將支架放入細胞培養(yǎng)箱，每隔30分鐘在支架同一面滴加50μl細胞培養(yǎng)基，2小時后翻面再滴加相同體積的細胞液，放入培養(yǎng)箱，每隔30分鐘在同一面50μl細胞培

95、養(yǎng)基，2小時后每孔中添加1.2ml培養(yǎng)基，將孔板放入培養(yǎng)箱中，如圖3.1。</p><p>　　圖3.1 細胞接種在支架上的流程示意圖</p><p>　?。?）每48小時更換細胞液，3天后進行MTS檢測。</p><p>　?。?）將支架取出放入48孔板中，每孔加入500μl培養(yǎng)基和100μlMTS檢測試劑，將孔板放入培養(yǎng)箱中，放置4小時。取出后每個實驗組取三個平

96、行式樣在490nm測量吸光度。</p><p><b>　　3.3結(jié)果與討論</b></p><p>　　本階段試驗也主要分為兩個部分，第一個部分是人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)。首先根據(jù)調(diào)研文獻發(fā)現(xiàn)人臍靜脈內(nèi)皮細胞不能多次傳代，否則細胞性質(zhì)、形態(tài)以及增殖都會發(fā)生不良變化，所以此實驗細胞都保持在3-4代之間進行MTS檢測。另外在細胞進行培養(yǎng)過程中，總結(jié)了細胞的增長速度為30小

97、時翻一番，所以經(jīng)解凍后的細胞（5×105）培養(yǎng)5-6天后細胞增值到7×106左右可進行實驗或者傳代。第三因人臍靜脈內(nèi)皮細胞的解凍較為困難，細胞不易存活，根據(jù)所購買得細胞培養(yǎng)基說明書上操作，解凍細胞時不進行離心，即直接將化凍的細胞加入到培養(yǎng)瓶中，24小時后待細胞成功貼壁更換新培養(yǎng)基（此處將細胞凍存液中的二甲基亞砜去除）。</p><p>　　第二部分是對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖能力的檢測。首先在實驗

98、方法上有一些注意點，第一是VEGF在滴加到支架上后，注意保持一定時間后再滴加細胞培養(yǎng)基，之后再進行細胞接種。原因是維持時間有助于膠原海綿吸收VEGF；在滴注細胞培養(yǎng)基并維持一定時間后，支架上膠原海綿會轉(zhuǎn)變成膠原凝膠狀態(tài)，細胞較干燥的膠原海綿更易于吸附于濕潤并具有培養(yǎng)基的膠體表面。第二是延長細胞吸附時間的操作步驟，在支架上下兩個表面分別滴加相同體積的細胞液，并使其在培養(yǎng)集中維持一定時間后，在孔板中加入液體培養(yǎng)基。經(jīng)調(diào)研文獻總結(jié)得到此方法有

99、助于增加細胞吸附在支架上的比例。經(jīng)多次重復實驗探究得出，支架上細胞接種量為8×104個效果較好，且細胞與MTS檢測試劑反應時間為4小時效果較好。</p><p>　　實驗中檢測了兩種不同量的VEGF對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖能力的影響，兩組支架上分別吸附有1μg和5μg的VEGF。經(jīng)實驗數(shù)據(jù)通過標準曲線標準化后得出圖3.2，可以看出加入1μgVEGF的細胞增殖與未加入VEGF的細胞增殖能力沒有較大區(qū)別，說明

100、1μgVEGF對內(nèi)皮細胞的增殖能力無明顯影響；而加入5μgVEGF的細胞增殖能力較明顯的大于未加入VEGF的細胞，說明5μgVEGF對內(nèi)皮細胞的增值能力有促進作用。說明5μgVEGF加載到支架上后仍具有一定生物活性，配合其他檢測生物活性的實驗結(jié)果，為之后動物體內(nèi)移植實驗做準備。</p><p>　　圖3.2 MTS法檢測細胞增殖能力結(jié)果統(tǒng)計。（a）MTS方法中吸光度與細胞數(shù)量的關(guān)系（標準曲線）；（b）VEGF用量

101、分別為0,1,5μg時內(nèi)皮細胞增值數(shù)量</p><p>　　在實驗之前對雙因子釋放系統(tǒng)文獻調(diào)研的過程中發(fā)現(xiàn)，VEGF在雙因子釋放系統(tǒng)中每個樣品的用量主要范圍是0.5-10μg，針對不同實驗設計用量會有一定幅度的偏差。不同用量的VEGF對于生物體作用的效果是不同的，用量過少不會產(chǎn)生效應，而用量過多在體內(nèi)試驗中會引發(fā)局部炎癥。針對于本實驗選擇的低濃度和中等濃度得出的實驗結(jié)果符合上述調(diào)研后的結(jié)論。</p>

102、<p>　　實驗中發(fā)現(xiàn)兩個問題，首先第一個問題是細胞數(shù)量較低。分析此原因首先我們考慮的原因是細胞接種的問題。由實驗結(jié)果可知將8×104個的細胞接種到支架上后，經(jīng)過分步滴加細胞液培養(yǎng)基的步驟后，細胞的吸附程度并不好，吸附率為10%左右。吸附率較低說明細胞不易貼附在膠原化后的支架上。此問題的原因可能為，第一因為支架是體積比較小的長方體，經(jīng)膠原化后再在其表面滴加細胞，細胞不易進入支架內(nèi)部生長，所以多聚集在膠原化的支架表面

103、，又因為滴加細胞液的時候由于水的張力會將一部分細胞沖離支架表面，在滴加細胞后經(jīng)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)有大部分細胞處在支架四周或在孔板的空白區(qū)域。第二由于調(diào)研文獻知膠原是很好的三維培養(yǎng)細胞的材料，貼壁細胞比較容易在此材料上貼壁生長。但是膠原的性質(zhì)會影響細胞的吸附程度，如膠原的酸堿性，膠原纖維孔隙性狀和大小等，所以細胞吸附度較低與之前制備膠原海綿的方法有關(guān)，在制備膠原海綿的步驟中滴加堿液的體積是經(jīng)公式計算的，并沒有單獨檢測膠原溶液的酸堿度，所以此處

104、控制的并不準確會影響之后細胞接種的過程。第三細胞在支架上的生長速度較慢，一般細胞不愿意在支架中生長，因為支架中缺乏營養(yǎng)物質(zhì)與氧氣，并且支架需要具有一定的表</p><p>　　第二個我們考慮細胞數(shù)量低是因為MTS染色方法的原因。在進行支架上細胞染色的檢測過程中用槍頭吹打支架周圍可以明顯看到孔板整體培養(yǎng)基顏色加深，說明一開始顏色的分布是不均勻的。同時在支架空隙內(nèi)部可以發(fā)現(xiàn)有一些夜色較深的部位但因為膠原凝膠處于支架內(nèi)

105、部所以用槍頭并不容易吹打。經(jīng)調(diào)研文獻發(fā)現(xiàn)也有類似實驗研究在進行MTS染色前用膠原水解酶將支架上膠原凝膠水解將顏色釋放出來。這樣可以增加染色的深度從而增加對應細胞數(shù)量。不過此原因并不確定因為考慮到細胞產(chǎn)生的甲瓚物質(zhì)是水溶性的，即使被膠原凝膠束縛也應該是少量的。</p><p>　　第二個問題是VEGF使用劑量的問題。 經(jīng)調(diào)研文獻發(fā)現(xiàn)大部分實驗使用的VEGF的劑量都較大，所以在進行體外活性檢測的實驗中都與對照組有明顯