多聚唾液酸修飾聚己內(nèi)酯納米纖維三維支架的脊髓損傷治療研究.pdf

1、抑制繼發(fā)性損傷和恢復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)受損通路是治療脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)的基本策略。多聚唾液酸(Polysialic acid，PSA)是一種內(nèi)源性多糖聚合物，與神經(jīng)細(xì)胞黏附因子結(jié)合后，促進(jìn)細(xì)胞遷移、突觸形成、神經(jīng)元和髓鞘再生等，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的受損通路修復(fù)中起重要作用。本研究采用PSA與生物可降解材料聚己內(nèi)酯(Polycaprolactone，PCL)復(fù)合，選擇腎上腺皮質(zhì)激素藥物甲基潑尼松龍(Methylpr

2、ednisolone，MP)為治療藥物，采用靜電紡絲技術(shù)分別制備PCL、PCL/MP、PCL/PSA、PCL/MP/PSA四種納米纖維三維支架。研究電紡參數(shù)(PCL濃度、溶劑配比、PSA濃度)對纖維形貌和直徑的影響，研究表明隨著PCL濃度的增加和高揮發(fā)性溶劑(丙酮)比例的上升，纖維串珠狀結(jié)構(gòu)減少、直徑增加，隨著PSA濃度的增加，纖維直徑減少，并確定PCL濃度150 mg/mL、PSA濃度15 mg/mL、溶劑(N，N-二甲基甲酰胺∶丙酮

3、=1∶1，v/v)為最理想的納米纖維三維支架參數(shù)，在此參數(shù)下PCL、PCL/MP、PCL/PSA、PCL/MP/PSA四種納米纖維的直徑分別為564.59±141.43 nm、512.85±69.85nm、500.34±150.7 nm、421.09±57.4 nm。采用紅外分光光度法分析納米纖維三維支架組成，研究發(fā)現(xiàn)PCL、MP、PSA制備成膜后特征峰良好未發(fā)生明顯偏移，表明三種組分保持物理性混合。以pH7.4 PBS為釋放介質(zhì)研究納

4、米纖維三維支架的體外釋藥行為，研究發(fā)現(xiàn)PSA含量增加會加快MP釋放速率，PSA濃度15 mg/ml時PCL/MP/PSA納米纖維三維支架12h內(nèi)MP累積釋放量達(dá)96％。以pH7.4 PBS為介質(zhì)研究納米纖維三維支架的體外降解特性并采用掃描電子顯微鏡(Scanning electron telescope，SEM)觀察纖維形貌，研究發(fā)現(xiàn)納米纖維三維支架24h內(nèi)降解組分主要為MP和PSA，PCL/MP/PSA纖維表面由于MP和PSA降解出現(xiàn)

5、大量空洞狀結(jié)構(gòu);PCL組分降解緩慢，可以長期維持支架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，4w后部分纖維發(fā)生斷裂。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴以原代星形膠質(zhì)細(xì)胞為模型，分別采用四唑鹽(3-(4，5-dimethylthiazolyl-2)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)比色法和SEM研究納米纖維三維支架的細(xì)胞毒性和相容性，結(jié)果顯示細(xì)胞與PCL、PCL/MP、PCL/PSA、PCL/MP/PSA四種納米纖維三維支架共

6、孵育2d后細(xì)胞存活率均大于80％，7d后細(xì)胞在PCL/MP/PSA納米纖維三維支架表面緊密黏附并深入深層孔隙結(jié)構(gòu)生長，表明納米纖維三維支架具有良好的生物安全性和細(xì)胞相容性。⑵以雌性SD大鼠為模型動物，采用脊髓全橫斷法建立SCI模型并在脊髓缺損處移植納米纖維三維支架。選擇腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)和細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3為檢測指

7、標(biāo)研究納米纖維三維支架對脊髓繼發(fā)性損傷的抑制作用。術(shù)后24 h，PCL、PCL/PSA組與SCI組(創(chuàng)傷對照組)相比TNF-α、 IL-6、Caspase-3含量無顯著性差異;而PCL/MP、PCL/MP/PSA組與SCI組相比TNF-α、IL-6、Caspase-3含量顯著降低，表明應(yīng)用MP治療脊髓損傷可抑制早期損傷部位TNF-α、 IL-6和Caspase-3蛋白表達(dá)，減輕繼發(fā)性損傷。⑶以雌性SD大鼠為模型動物，采用脊髓全橫斷法建立

8、SCI模型并在脊髓缺損處移植納米纖維三維支架。采用Basso，Beattie and Bresnahan(BBB)運動學(xué)功能評分考察脊髓損傷大鼠的運動功能。結(jié)果顯示，術(shù)后7w與SCI組相比，各治療組BBB評分均有顯著提高，PCL/MP/PSA組的運動學(xué)功能恢復(fù)狀況顯著優(yōu)于其他各治療組，表明MP和PSA聯(lián)合治療效果最佳。術(shù)后7 w，取脊髓斷端組織制備石蠟切片進(jìn)行LFB染色并采用透射電子顯微鏡(Transmission electron t

9、elescope，TEM)觀察組織超微結(jié)構(gòu)，PCL/MP/PSA組髓鞘數(shù)目、直徑及板層狀結(jié)構(gòu)完整性顯著優(yōu)于其他各組。采用免疫組織化學(xué)法和免疫熒光法研究神經(jīng)元和NF200、GFAP蛋白表達(dá)，PCL/MP/PSA組與其他各組相比神經(jīng)元數(shù)量和NF200含量顯著增加，GFAP含量顯著降低，表明MP和PSA聯(lián)合治療可以有效提高神經(jīng)元和軸突存活率，并抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生。進(jìn)一步采用免疫熒光法研究Iba1蛋白表達(dá)，PCL、PCL/PSA組與SC

10、I組相比Iba1含量無顯著性差異; PCL/MP、PCL/MP/PSA組與SCI組相比Iba1含量顯著降低，應(yīng)用MP治療脊髓損傷可抑制損傷部位小膠質(zhì)細(xì)胞活化。⑷PCL/MP/PSA納米纖維三維支架可以發(fā)揮MP和PSA的聯(lián)合治療效果，有效抑制脊髓損傷后急性炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)，改善脫髓鞘化并抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增殖，提高神經(jīng)元和軸突生存率，最終改善脊髓損傷后大鼠的運動學(xué)功能，為組織工程支架應(yīng)用于脊髓損傷的修復(fù)治療提