土壤細(xì)菌的熒光染色計(jì)數(shù)方法研究及一株放線菌的分離鑒定.pdf

1、微生物資源非常豐富，為了持續(xù)開發(fā)微生物產(chǎn)物，造福人類，人們必須尋找更多類型的微生物，但是，分子生態(tài)學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在人們所培養(yǎng)的微生物僅為自然界存在微生物中的少數(shù)，約有1.0％，或更少，究其原因是在自然界中存在的微生物大多不能在常規(guī)的分離平板上生長，他們是活的，但是尚未培養(yǎng)的微生物.長久以來都是利用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)學(xué)方法對土壤微生物進(jìn)行研究，利用熒光染料可直接對細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，并在熒光顯微鏡下直接計(jì)數(shù)。這類直接計(jì)數(shù)的方法被越來越多的運(yùn)

2、用于土壤等環(huán)境樣品中的微生物數(shù)量檢測和計(jì)數(shù)，對估算環(huán)境中的微生物數(shù)量有重要意義。
　　 為了研究土壤微生物中未培養(yǎng)微生物的情況，本文以南京土壤以及江西紅壤為研究對象，采用羧基熒光素二醋酸酯（6-CFDA），4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）熒光計(jì)數(shù)，以及傳統(tǒng)的稀釋平板計(jì)數(shù)等方法研究了土壤的微生物數(shù)量、比較了短時(shí)間滅菌后土壤CFDA與平板計(jì)數(shù)結(jié)果的差異，并對CFDA在不同條件下的熒光染色效果進(jìn)行研究。
　　 將GP

3、F標(biāo)記大腸桿菌梯度稀釋，在熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光顯微計(jì)數(shù)，以顯微鏡視野菌數(shù)為橫坐標(biāo)，平板計(jì)數(shù)結(jié)果為縱坐標(biāo)，作熒光顯微鏡計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　 通過采用不同pH值的PBS緩沖液，測定CFDA標(biāo)記DH5α的效果，結(jié)果表明，在pH值7.4-7.8間，染色效果較好，pH值7.6時(shí)染色效果最佳。CFDA對八株不同屬的菌株進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)CFDA對革蘭氏陽性菌的效果要好于革蘭氏陰性菌。對BS169的染色效果最好。
　　 對DH5α進(jìn)行CF

4、DA染色計(jì)數(shù)，以及平板計(jì)數(shù)，結(jié)果表明，CFDA的計(jì)數(shù)結(jié)果為1ml DH5α樣品中，菌體的數(shù)量為47.38×107，而DH5α的平板計(jì)數(shù)結(jié)果為42.25×107個(gè)。
　　 通過熒光染料CFDA與DAPI染色計(jì)數(shù)和平板計(jì)數(shù)比較了經(jīng)過三種處理方式的不同的土地的微生物數(shù)量.結(jié)果表明：土壤中能被DAPI染色的微生物為CFDA計(jì)數(shù)結(jié)果的1.5倍左右，這說明土壤中有大量的微生物處于存活狀態(tài)。但是同一種土壤樣品的CFDA染色計(jì)數(shù)結(jié)果比傳統(tǒng)的平板

5、計(jì)數(shù)結(jié)果高約2個(gè)數(shù)量級，說明有大量的未培養(yǎng)微生物的存在。
　　 通過對土壤短時(shí)間高壓蒸汽滅菌后，對其進(jìn)行CFDA染色計(jì)數(shù)和平板計(jì)數(shù)。平板計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示沒有活的微生物存在，但是通過CFDA染色計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，樣品中里面仍然有大量的存活狀態(tài)的微生物存在。平板計(jì)數(shù)法所采用培養(yǎng)基本身不能還原土壤微生物生存的真實(shí)環(huán)境，許多微生物能夠在土壤中存活生長，不能在LB培養(yǎng)基上生長，形成菌落。
　　 利用細(xì)菌濾器模擬土壤環(huán)境，從土壤中分離到一株放