3株放線菌的分離鑒定及其遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的構(gòu)建與優(yōu)化.pdf

1、土壤微生物鏈霉菌是天然抗生素的重要來源，通過對(duì)土壤微生物鏈霉菌進(jìn)行了分離、鑒定、遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄因子的功能研究，有助于挖掘其獨(dú)特的微生物資源和生物合成潛能，為重要基因簇功能的研究和開發(fā)在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域迫切需要的藥物奠定基礎(chǔ)。
　　本研究以內(nèi)蒙古赤峰寧城縣青山林場(chǎng)土樣為材料，共分離得到63株鹽堿地放線菌。分別對(duì)這63株菌進(jìn)行生物活性檢測(cè)，共獲得7株抑菌效果較好的菌株。然后對(duì)這7株放線菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的構(gòu)建，其中3株放線菌

2、的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)構(gòu)建成功。
　　對(duì)構(gòu)建好遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的3株放線菌S-5、S-27和S-28進(jìn)行菌種鑒定，包括形態(tài)觀察、培養(yǎng)特征、生理生化及16S rDNA鑒定，最后初步鑒定這3株鏈霉菌S-5、S-27和S-28分別為Streptomyces alogtiseolus、treptomyces albus和streptomyces bacillari。
　　通過接合轉(zhuǎn)移的方式對(duì)3株鏈霉菌S-5、S-27和S-28進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的

3、構(gòu)建，且3株鏈霉菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)均構(gòu)建成功。對(duì)其中一株鏈霉菌S-28的接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，包括:培養(yǎng)基的選擇、抗生素濃度、MgCl2的濃度、S-28孢子熱激條件、預(yù)萌發(fā)時(shí)間、供受體比例和接合時(shí)間等條件，最后確定了S-28菌株接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的最優(yōu)條件。
　　經(jīng)基因組草圖測(cè)序分析，S-28菌株全基因組全長(zhǎng)大約7，864，237bp，共獲得91個(gè)scaffolds，93個(gè)contigs，GC含量為71.95％。軟件預(yù)測(cè)CDs有6，882個(gè)

4、，通過多種數(shù)據(jù)庫對(duì)所得基因進(jìn)行功能分類與注釋，以及antiSMASH在線分析，共有38個(gè)基因簇，表明該菌株含有較為豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物資源，有較高的開發(fā)利用價(jià)值。
　　采用基因置換和框內(nèi)缺失技術(shù)，對(duì)bldA基因和Ectione基因簇的MarR轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行基因敲除，并對(duì)MarR轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行異源表達(dá)。結(jié)果:成功表達(dá)了MarR轉(zhuǎn)錄因子蛋白。利用接合轉(zhuǎn)移的方法，將敲除載體pKC1132-L+Kan+R導(dǎo)入到S-28中，經(jīng)抗性篩選及PCR驗(yàn)證