四季蜜龍眼LFY基因啟動(dòng)子克隆及嫁接新梢轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析.pdf

1、本研究以龍眼的兩個(gè)品種（四季蜜和立冬本）為材料，對(duì)四季蜜成花變異分子機(jī)制進(jìn)行初步探究。已有的研究表明，四季蜜易成花的特性與其葉芽中 LFY表達(dá)量的增加有關(guān)，在此基礎(chǔ)上，本研究從兩方面入手進(jìn)行進(jìn)一步的研究，一方面，首先克隆四季龍眼LFY基因的啟動(dòng)子，和普通龍眼LFY啟動(dòng)子進(jìn)行序列比較，研究四季蜜 LFY的表達(dá)變異是否與啟動(dòng)子變異有關(guān)；另一方面通過(guò)嫁接新梢轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析四季龍眼和普通龍眼嫁接新梢中差異表達(dá)的基因，以期找到與四季蜜成花特性發(fā)

2、生變異相關(guān)的調(diào)控基因，了解龍眼成花的分子調(diào)控機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：
　　1、四季蜜LFY同源基因啟動(dòng)子的克隆
　　以四季蜜的幼葉為材料，提取基因組DNA，以已知的四季蜜龍眼LFY同源基因DNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，用染色體步移方法，克隆得到了長(zhǎng)度為1,227bp的四季蜜啟動(dòng)子序列。對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明：該啟動(dòng)子含有典型的TATA-box和CAAT-box，以及調(diào)控生理周期、響應(yīng)光反應(yīng)、MYB結(jié)合位點(diǎn)和赤霉素等反應(yīng)元

3、件。將四季蜜 LFY啟動(dòng)子與立冬本啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)分析，共發(fā)現(xiàn)六處堿基差異，有一個(gè)堿基的差異在調(diào)控作用元件中。
　　2、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析
　　以四季蜜和立冬本的嫁接新梢為材料，用改良的 TB法提取 RNA，并用Illumina平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果在四季蜜和立冬本中分別獲得27,723,240個(gè)和25,603,968個(gè)clean reads，組裝后，在四季蜜中共獲得了平均長(zhǎng)度為481bp的unigene40,9

4、82個(gè)，在立冬本中獲得了平均長(zhǎng)度為701bp的unigene36,527個(gè)；最后獲得平均長(zhǎng)度為703bp的All-unigene40,513個(gè)。
　　對(duì)龍眼嫁接新梢轉(zhuǎn)錄組的 All-unigene的 cds進(jìn)行 blast分析，共獲得了30,963個(gè) CDS片段；在ESTscan數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)轉(zhuǎn)錄組的 cds進(jìn)行分析，共獲得了1,452個(gè) EST.scan片段；將 All-unigene和 COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，共有10,646條可以

5、與數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因具有相似性；共有24,855條All-unigene可以與GO數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因具有相似性，共有31,221個(gè)All-unigene可以與NR數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因具有相似性，有27,716條All-unigene可以和NT數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因具有相似性，有19,028條All-unigene與SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因具有相似性。從測(cè)序數(shù)據(jù)看，測(cè)序結(jié)果較好。
　　對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，篩選出了四季蜜和立冬本間與開(kāi)花相關(guān)的

6、538條顯著差異表達(dá)的基因，其中下調(diào)表達(dá)基因數(shù)目是上調(diào)表達(dá)的2倍。538個(gè)基因在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中歸類到42個(gè)GO terms，建立了2,365條對(duì)應(yīng)關(guān)系；538個(gè)基因比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中，其中241個(gè)基因歸類到69個(gè)途徑中。對(duì)這些途徑進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了一些可能與四季蜜易成花相關(guān)的基因，包括一些酶催化基因、糖降解基因以及參與 C/N比值調(diào)控的基因等。測(cè)序結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，開(kāi)花途徑中三個(gè)抑制基因TFL1、FLC和SVP在四季蜜龍眼嫁接新梢中的表達(dá)有不

7、同程度下降。
　　3、四季蜜和立冬本成花相關(guān)基因cDNA和基因組序列的克隆、比對(duì)和分析
　　以四季蜜和立冬本幼葉、葉芽為材料，分別提取DNA和RNA，對(duì)開(kāi)花相關(guān)途徑涉及的關(guān)鍵基因(SVP、TFL和 FLC)進(jìn)行克隆。代號(hào)為 SVP645的基因兩個(gè)品種間氨基酸序列有一些差異性，而SVP2719兩個(gè)品種間氨基酸序列沒(méi)有差異；兩個(gè)品種FLC基因氨基酸序列沒(méi)有差異；TFL6027基因的cDNA和DNA序列在兩個(gè)品種間都沒(méi)有差異，而T