養(yǎng)殖對蝦病毒性流行病學(xué)調(diào)查及高通量基因檢測芯片的研究.pdf

1、隨著高密度集約化養(yǎng)殖模式的到來對蝦病毒性疾病對對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成的損失正日益增大甚至嚴(yán)重制約了對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。對蝦病毒廣泛存在于對蝦養(yǎng)殖區(qū)近海海域的甲殼類體內(nèi),并且病毒傳播途徑復(fù)雜目前尚無特效的治療方法。經(jīng)過幾代水產(chǎn)科研人員多年對病原生物學(xué)的研究、示范養(yǎng)殖試驗(yàn),結(jié)合成功的養(yǎng)殖生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn),認(rèn)為只有從樹立健康養(yǎng)殖觀念,從養(yǎng)殖管理上,采取綜合預(yù)防措施,對養(yǎng)殖各階段的對蝦進(jìn)行病原檢測從而有效地預(yù)防病毒病的發(fā)生。
　　 本論文首先進(jìn)行了對蝦常

2、見病毒病的流行病學(xué)調(diào)查分析,基本了解了對蝦病毒病的發(fā)病趨勢。通過進(jìn)行對蝦種類與病毒發(fā)病關(guān)系、養(yǎng)殖地區(qū)與病毒發(fā)病關(guān)系、養(yǎng)殖季節(jié)與病毒發(fā)病關(guān)系以及病毒陽性比率等方面的分析得出WSSV、IHHNV和HPV是對蝦病毒病中最主要的三種病原,其中WSSV的感染率占到了總病毒感染的50.52％,IHHNV和HPV分別占到了34.90％和11.98％。
　　 本論文根據(jù)Lightner藍(lán)皮書、國際獸疫局(OIE)水生動(dòng)物疾病名錄、亞太水產(chǎn)養(yǎng)殖中

3、心網(wǎng)絡(luò)(NACA)水生動(dòng)物疾病名錄等,選擇導(dǎo)致養(yǎng)殖對蝦類的發(fā)病的八種病毒作為研究對象,針對這些研究對象,在本實(shí)驗(yàn)室先前設(shè)計(jì)篩選出的27對對蝦病毒擴(kuò)增引物(其中每種對蝦對應(yīng)三對特異引物)和對應(yīng)的54條雜交探針中,按照退火溫度最接近和每條擴(kuò)增片段大小容易通過瓊脂糖凝膠電泳區(qū)分的原則,并以實(shí)現(xiàn)病毒在同一單管中均能理想的進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增為目的,對各病毒特異引物進(jìn)行組合,最終獲得了一套既能實(shí)現(xiàn)單管多重PCR擴(kuò)增又能獲得較理想基因芯片雜交結(jié)果的引

4、物和對應(yīng)探針。
　　 本文針對多重RT-PCR檢測技術(shù)的需要,首先進(jìn)行了對蝦病毒多重PER反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化,包括Mg2+濃度、酶濃度、退火溫度和反應(yīng)循環(huán)數(shù)等,建立了一套對六種對蝦病毒-WSSV、IHHNV、HPV、TSV、BP、IMNV-同步擴(kuò)增的多重PER和基因芯片技術(shù)。經(jīng)過多次反復(fù)優(yōu)化試驗(yàn),最終選擇50μL多重PCR反應(yīng)體系中25mmol／LMg2+最佳用量為5.0μL,ExTaq酶最佳用量為0.75μL,反應(yīng)程序中

5、最佳退火溫度為55.5℃。最后進(jìn)行了多重PCR檢測方法靈敏度和特異性的驗(yàn)證,并把該方法應(yīng)用到了實(shí)際樣品檢測中。
　　 本研究利用基因芯片技術(shù)基本實(shí)現(xiàn)了八種對蝦病毒的同時(shí)檢測,進(jìn)行了基因芯片陣列的設(shè)計(jì)。芯片陣列排列主要包括陽性質(zhì)控、陰性質(zhì)控、外質(zhì)控和內(nèi)質(zhì)控等組成的質(zhì)控系統(tǒng)以及由特異病毒探針組成的樣品雜交區(qū)；將多重RT-PCR技術(shù)與基因芯片相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了真正意義上的疾病高通量檢測。針對該技術(shù)本文進(jìn)行了它的可行性、特異性以及應(yīng)用性方面