鹿副結(jié)核病酶標(biāo)診斷方法的研究.pdf

1、副結(jié)核病是由禽分枝桿菌副結(jié)核亞種(Mycobacteriumaviumsubsp)引起牛、羊、鹿、駱駝等以反芻動(dòng)物為主多種動(dòng)物共患的慢性傳染性腸炎。本病廣泛流行于世界各國(guó)，每年造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。 本研究培養(yǎng)副結(jié)核分枝桿菌經(jīng)過(guò)超聲波粉碎處理，過(guò)葡聚糖G200層析柱和親和層析柱提純抗原。培養(yǎng)草分枝桿菌，經(jīng)過(guò)超聲波粉碎處理、離心取上清獲得草分枝桿菌吸收抗原。飽和硫酸銨鹽析法粗提鹿血清IgG，然后過(guò)葡聚糖G200凝膠層析柱和纖維素DEA

2、E52柱精提IgG，免疫兔子制備兔抗鹿IgG抗體，然后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，制備兔抗鹿酶標(biāo)抗體。 采用副結(jié)核親和層析抗原，待檢鹿血清以草分枝桿菌抗原吸收，建立用于檢測(cè)鹿副結(jié)核病血清抗體的間接ELISA診斷方法。然后，對(duì)有代表性的鹿群進(jìn)行副結(jié)核病抗體檢測(cè)，獲得相應(yīng)的流行病學(xué)資料，從而為防制鹿副結(jié)核病提供一定的依據(jù)。結(jié)果如下： 間接ELISA程序：將親和抗原以包被液(碳酸鹽緩沖液)稀釋成最適包被濃度40ug/ml，分別吸取1

3、00ul，包被反應(yīng)板置37℃溫育3h后，再于4℃冰箱過(guò)夜，同時(shí)各板設(shè)抗原、抗體和酶標(biāo)抗體對(duì)照。次日甩去包被液，以含0.05％Tween-20的0.01MpH7.4PBS(PBST)作為洗滌液，洗滌3次，每次3min(3×3min洗滌)。取血清100ul，分別加入草吸抗原100ul，PBS800ul，37℃感作1h，中間振搖數(shù)次。再取上清液100ul，加入900ul酶標(biāo)抗體稀釋液中，吸取該樣品，每孔加入100ul，37℃作用1.5h，3×

4、3min洗滌。將酶標(biāo)抗體用0.1％BSA-PBST稀釋成工作濃度1：4000，每孔加入100ul，37℃作用1.5h，3×3min洗滌。加入新配制的底物(OPD)溶液100ul，37℃濕盒避光作用20min。每孔加2MH2SO4一滴終止反應(yīng)，以DG-3022A型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定OD值(波長(zhǎng)490nm)，判定結(jié)果。 利用本研究建立的鹿副結(jié)核病間接ELISA診斷方法對(duì)九臺(tái)、凈月、農(nóng)大和上海4個(gè)鹿場(chǎng)的760頭份鹿血清進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性6