耐藥結(jié)核病診斷新技術(shù)

1、,,,耐藥性結(jié)核病診斷新技術(shù),主講人：吳壽強(qiáng)時(shí)間：2016年7月28日,主要內(nèi)容,一、概述二、基因芯片技術(shù)三、熔解曲線技術(shù),全球范圍內(nèi)結(jié)核病疫情嚴(yán)重 患病率高： 新發(fā)患者1040萬(wàn)/年，其中有120萬(wàn)（11%）HIV患者； 死亡率高：每年死亡人數(shù)達(dá)140萬(wàn)（13.46%），HIV/TB:死亡人數(shù)40萬(wàn)（33.33%）； 耐藥率高： 48萬(wàn)新發(fā)的MDR-TB病例和10萬(wàn)耐利福平結(jié)核?。≧R-TB）病例；

2、 接受MDR檢測(cè)、報(bào)告和治療的MDR-TB不足1/3，接受治療的MDR-TB治愈成功率只有50%,2016年全球結(jié)核病報(bào)告,2015年全球估計(jì)MDR-TB患者數(shù),結(jié)核病快速及時(shí)診斷是結(jié)核病防控重要因素,靈敏準(zhǔn)確,操作簡(jiǎn)便,檢測(cè)時(shí)間短,閉管檢測(cè),檢測(cè)位點(diǎn)全面,對(duì)新型耐藥檢測(cè)技術(shù)的要求,,,,基因芯片技術(shù),結(jié)核病耐藥與基因,64-68% rps L 基因突變,70% emb B基因突變,,,,,,70%,65%,耐藥基因,

3、93%,95%,95% rpo B基因突變,利福平,異煙肼,50-70% kat G基因突變5-10% inh A基因突變6-13% ahp C基因啟動(dòng)子區(qū)域突變,鏈霉素,乙胺丁醇,多數(shù)研究報(bào)告提示：耐藥的發(fā)生與結(jié)核桿菌的基因突變有關(guān)?？傮w上是基因一個(gè)或幾個(gè)核苷酸突變（表現(xiàn)增加、缺失、替代），造成核苷酸編碼錯(cuò)誤致氨基酸錯(cuò)位排列，影響藥物與靶位酶結(jié)合產(chǎn)生耐藥,基因芯片（原理）,激光共焦掃描儀,軟件判讀,樣品制備儀,雜交儀,基因

4、芯片方法是基于結(jié)核桿菌的利福平和異煙肼耐藥性相關(guān)的rpoB/katG/inhA的基因位點(diǎn)發(fā)生突變，通過(guò)PCR擴(kuò)增、和固定于尼龍膜上的寡核苷酸探針進(jìn)行雜交、掃描，檢測(cè)熒光信號(hào)的有無(wú)，判斷特定位點(diǎn)的突變情況和結(jié)核菌耐藥性。,基因芯片儀和試劑獲國(guó)家SFDA和歐盟CE認(rèn)證,12,基因芯片法,,利福平的耐藥位點(diǎn),同時(shí)鑒定MTC與21種NTM,非結(jié)核分枝桿菌,在國(guó)內(nèi)4個(gè)省的4個(gè)地市級(jí)CDC進(jìn)行了評(píng)估。,結(jié)核病和非結(jié)核的診斷,特 點(diǎn),標(biāo)本：菌株、涂

5、陽(yáng)痰標(biāo)本 時(shí)間：約8小時(shí)優(yōu)點(diǎn)：高通量靈敏度、特異度高,國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室推薦建議,基因芯片可以用于: 可疑耐藥結(jié)核病患者篩查,它有望代替利福平和異煙肼的傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn),推薦理由:在我國(guó)獲得注冊(cè)證書(shū)；國(guó)內(nèi)研究顯示其敏感性和特異性較好；民族品牌數(shù)據(jù)顯示在我國(guó)具有可行性,符合成本效果；,可能使用層級(jí): 地市和省級(jí)（醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病預(yù)防機(jī)構(gòu)）,,,,探針熔解曲線技術(shù),工作原理,在一定

6、環(huán)境下，DNA雙鏈在其長(zhǎng)度和序列一定時(shí)，Tm值也一定，當(dāng)發(fā)生錯(cuò)配時(shí)，Tm值下降，下降的幅度與發(fā)生錯(cuò)配的堿基數(shù)目、類(lèi)型和位置有關(guān)。,ΔTm,96%利福平耐藥突變發(fā)生在rpoB507-533共81bp區(qū)域內(nèi),利福平耐藥突變檢測(cè)體系示意圖,根據(jù)靶序列熔點(diǎn)的變化，檢測(cè)rpoB基因 是否含有突變，獲得利福平耐藥信息,根據(jù)不同的ΔTm值可以判斷出ropB可能不同的堿基發(fā)生突變,根據(jù)不同的ΔTm值可以判斷出ropB可能不同的堿基發(fā)生突變,異煙肼耐藥

7、突變檢測(cè)體系示意圖,通過(guò)檢測(cè) katG315、inhA 啟動(dòng)子和、ahpC 啟動(dòng)子區(qū)、inhA94 、密碼子的突變與否確定樣品對(duì)異煙肼的耐藥性。,根據(jù)不同的ΔTm值可以判斷出異煙肼不同的堿基序列發(fā)生突變,根據(jù)不同的ΔTm值可以判斷出異煙肼不同的堿基序列發(fā)生突變,乙胺丁醇,鏈霉素,氟喹諾酮,每個(gè)突變都表現(xiàn)出特有的譜線 對(duì)應(yīng)獨(dú)特的熔點(diǎn), 軟件可以自動(dòng)地給出突變類(lèi)型,即使發(fā)生不均一突變的情況,也可以分辨出來(lái).,步驟二加入1-96個(gè)提取樣本

8、到檢測(cè)管中,步驟三集成多重PCR和結(jié)果自動(dòng)報(bào)告,步驟一自動(dòng)提取1-24份樣本,操作流程,總耗時(shí)約3小時(shí)，手工操作時(shí)間約15分鐘,（一）DNA提取,,～40 min,,高質(zhì)量的樣本DNA,（二）加入PCR反應(yīng)管,（三）PCR過(guò)程和自動(dòng)判讀,痰標(biāo)本純化DNA qPCR 檢測(cè)結(jié)果,靶序列擴(kuò)增曲線：,內(nèi)參擴(kuò)增曲線：,不同標(biāo)本的內(nèi)參擴(kuò)增結(jié)果一致，顯示純化后的DNA溶液對(duì)擴(kuò)增無(wú)抑制。,高純度模板DNA是分子檢測(cè)可靠性的關(guān)鍵！,臨床試驗(yàn)結(jié)果