布魯氏菌病與結(jié)核病快速診斷技術(shù)的研究.pdf

1、布魯氏菌病是由布魯氏菌屬的細(xì)菌侵入機(jī)體，進(jìn)而引起傳染變態(tài)反應(yīng)性的人畜共患傳染病。布魯菌可感染人類(lèi)、多種家畜和野生動(dòng)物，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此對(duì)該病及時(shí)作出診斷有利于降低經(jīng)濟(jì)損失。為此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼建立了很多方法，但是這些方法或技術(shù)性強(qiáng)不適于基層使用，或價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，或結(jié)果不穩(wěn)定。所以，建立敏感性高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，便于基層推廣使用的診斷方法是非常有必要的。本研究應(yīng)用膠體金免疫層析法（GICA）研制一種布

2、魯氏菌病多聯(lián)蛋白快速診斷試劑條，為布病的快速診斷提供了技術(shù)支持。
　　結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染所導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)感染為主的人畜共患慢性傳染病，對(duì)人畜健康損害嚴(yán)重。全世界目前約有三分之一的人感染該病。目前，結(jié)核病呈現(xiàn)出擴(kuò)大趨勢(shì)。但現(xiàn)有的用于診斷結(jié)核感染的方法都存在或多或少的缺陷，突出問(wèn)題是靈敏度、特異性低。因此需要一種新的診斷技術(shù)以稱(chēng)補(bǔ)現(xiàn)有方法的不足。據(jù)此，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)建立了基質(zhì)金屬蛋白酶1和γ-干擾素體外釋放試驗(yàn)，該法

3、具有較高的敏感性和特異性，為結(jié)核病的早期診斷提供新的技術(shù)方法。現(xiàn)將主要研究成果報(bào)告如下：
　　1.布魯菌外膜蛋白OMP31的表達(dá)、純化：通過(guò)分子克隆技術(shù)對(duì)目的基因omp31進(jìn)行擴(kuò)增，然后將omp31目的基因連接到PMD18-T載體上，經(jīng)過(guò)PCR、酶切和DNA測(cè)序鑒定正確后，構(gòu)建pET-32a-omp31重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到DE3表達(dá)菌中進(jìn)行經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，最后進(jìn)行westernblot檢測(cè)。SDS結(jié)果顯示成功表達(dá)了omp31融合蛋

4、白，并獲得了高表達(dá)量和高純度的蛋白，westernblot檢測(cè)結(jié)果證明了omp31融合蛋白具有較高的免疫原性，為后續(xù)的免疫學(xué)檢測(cè)奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　2.檢測(cè)布魯氏菌多聯(lián)蛋白試紙條的制備：用檸檬酸三鈉還原劑制備膠體金溶液，在此基礎(chǔ)上摸索膠體金標(biāo)記金黃色葡萄球菌A蛋白的最佳條件；并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量鑒定。用透射電鏡和紫外/可見(jiàn)光譜儀（400nm-700nm）分析顯示，制備的膠體金顆粒大小均一，約為20nm，適合免疫標(biāo)記。膠體金標(biāo)記金黃色葡

5、萄球菌A蛋白最pH為6.2，最適穩(wěn)定濃度為6μg/ml。最佳抗原包被量為1μL/cm，人IgG的最佳包被濃度為2mg/ml。用研制的OMP31和BP26多聯(lián)蛋白試紙條與僅有OMP31或BP26蛋白作為單一檢測(cè)線(xiàn)的試紙條對(duì)15份布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，多聯(lián)蛋白試紙條陽(yáng)檢率為100％，與僅有OMP31或BP26蛋白作為單一檢測(cè)線(xiàn)檢測(cè)結(jié)果相同，與用琥紅平板試驗(yàn)（RBPT）符合率為100%。檢測(cè)其他血清結(jié)果顯示該試紙條具有良好的特異性。試

6、紙條可檢出稀釋125倍的羊布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清。本試紙條在4℃可保存6個(gè)月，表明該檢測(cè)方法具有較高的穩(wěn)定性。
　　3.建立肺結(jié)核IFN-γ和基質(zhì)金屬蛋白酶1體外釋放試驗(yàn)診斷方法：分離提取結(jié)核病患者（結(jié)核組，20例）和健康人（健康對(duì)照組，20例）外周血淋巴細(xì)胞；用結(jié)核桿菌侵染12h后，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中MMP-1和IFN-γ濃度。結(jié)果顯示結(jié)核組MMP-1與IFN-γ濃度明顯高于健康對(duì)照組。檢測(cè)時(shí)間為