結(jié)核病診斷tspot實驗

1、匯 報 人：培訓(xùn)專業(yè)：呼吸內(nèi)科指導(dǎo)老師： 2016.12.14,02,結(jié)核病實驗室檢查及意義,目錄,01. 分枝桿菌概述,02. 結(jié)核病實驗室檢查,03. 小結(jié),2,分枝桿菌概述,01,3,分枝桿菌屬分類,結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)非結(jié)核分枝桿菌（NTM）麻風(fēng)分枝桿菌（M.leprae）,4,結(jié)核分枝桿菌的發(fā)現(xiàn),1882年 德國柯赫醫(yī)生發(fā)現(xiàn)結(jié)核致病菌----結(jié)核桿菌,5,結(jié)核桿菌的變遷

2、,1897年提出結(jié)核病的飛沫傳播1922年，卡介苗為預(yù)防結(jié)核病首次對新生兒接種1945年，鏈霉素的問世使肺結(jié)核不再是不治之癥?！?6,結(jié)核分枝桿菌—特點,(M.tuberculosis),生物學(xué)主要特點：1. 細(xì)胞壁中含有大量脂質(zhì)2.引起的疾病都呈慢性并伴肉芽腫3.抗酸染色陽性,7,結(jié)核病,,由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性感染性疾病,,8,結(jié)核病—臨床表現(xiàn),9,結(jié)核病發(fā)病機制,起始期,細(xì)胞外增殖期和傳播期,共生期,T細(xì)胞反應(yīng)期

3、,10,結(jié)核病發(fā)病機制,11,結(jié)核病發(fā)病機制,12,活動性結(jié)核與潛伏感染,13,結(jié)核病—診斷,實驗室檢查,影像檢查,病理檢查,+,臨床 指征,14,結(jié)核桿菌實驗室檢查,02,結(jié)核診斷--臨床應(yīng)用,幾乎所有的臨床內(nèi)科科室都需要結(jié)核的鑒別診斷：發(fā)熱待查，結(jié)核排篩結(jié)腦的鑒別診斷胸腹水患者待查兒童結(jié)核,16,結(jié)核桿菌,結(jié)核病實驗室檢查,細(xì)菌學(xué)檢查,免疫學(xué)檢查,分子生物學(xué)檢查,,,,分枝桿菌分離培養(yǎng)分支桿菌藥敏試驗分枝桿菌菌種

4、鑒定,,體液免疫學(xué)診斷,細(xì)胞免疫學(xué)診斷,DNA測序DNA探針技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,,17,結(jié)核分枝桿菌-實驗室檢查,涂片鏡檢,細(xì)菌學(xué)檢查,適用于多種標(biāo)本；操作簡便，價格低廉。 2份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性； 1份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性+肺部影像學(xué)檢查符合活動性肺結(jié)核表現(xiàn)。肺結(jié)核治療評估的主要依據(jù)之一,18,結(jié)核分枝桿菌-實驗室檢查,缺點：不能區(qū)別是否為非結(jié)核分枝桿菌 不能區(qū)別死活菌。

5、 結(jié)核桿菌暴露于異煙肼時，某些條件會失去抗酸性，出現(xiàn)假陰性。 檢測靈敏度較低（104-105 個細(xì)菌/毫升）。,19,結(jié)核桿菌培養(yǎng),細(xì)菌學(xué)檢查,傳統(tǒng)方法：L-J固體培養(yǎng)基快速培養(yǎng)法: 檢測細(xì)菌生長過程中代謝產(chǎn)生的CO2或消耗的O2，顯微鏡直接觀察、變色液體培養(yǎng)基等BACTEC MGIT960系統(tǒng) BACTEC460系統(tǒng)、、Bact/ALERT 3D、ESPⅡ等。,痰培養(yǎng)、其他標(biāo)本培養(yǎng),20,結(jié)核桿

6、菌培養(yǎng),陰性培養(yǎng),陽性培養(yǎng),BACTEC? MGIT? 960/320 指示器系統(tǒng),21,結(jié)核桿菌培養(yǎng),1份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性+1份痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng) 痰涂片陰性，肺部影像學(xué)檢查符合活動性肺結(jié)核影像學(xué)表現(xiàn)+1份痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性,用于耐多藥結(jié)核療效判定,結(jié)核菌培養(yǎng)臨床價值—確診結(jié)核,22,抗酸桿菌培養(yǎng)優(yōu)缺點,敏感性較直接涂片法高，理論上10-100條菌/毫升可檢出陽性；特異性較直接涂片法高，可以

7、從菌落生長速度、色素產(chǎn)生初步判斷非結(jié)核分枝桿菌；分離出具有活力的純培養(yǎng)物，為進一步藥敏試驗提供基礎(chǔ)。,需時長，根據(jù)接種量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可見菌落。結(jié)果受標(biāo)本保存運送時間、培養(yǎng)基成分和質(zhì)量、前處理方法等影響， 操作較直接涂片法復(fù)雜，需經(jīng)嚴(yán)格培訓(xùn) 。需培養(yǎng)基凝固滅菌器、離心機、渦旋振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱等設(shè)備。成本是直接涂片法的7-8倍。,23,細(xì)胞免疫學(xué)檢查,結(jié)核菌素皮膚試驗（PPD試驗）γ干擾素釋放試驗（T-

8、SPOT試驗）,24,免疫學(xué)檢查,細(xì)胞免疫學(xué)檢查,PPD--結(jié)核菌素試驗,遲發(fā)型細(xì)胞超敏反應(yīng)1）方法：1:2000 OT或PPD液0.1毫升(5單位)，左前臂屈側(cè)中部皮內(nèi)注射，48-72h測量皮膚硬結(jié)的直徑。,25,PPD--結(jié)核菌素試驗,2）判斷標(biāo)準(zhǔn)：陰性≤4mm弱陽性5-9mm陽性10-19mm，強陽性≥20mm或局部出現(xiàn)水泡與壞死,26,PPD--結(jié)核菌素試驗,3)結(jié)核菌素試驗的意義陰性：無結(jié)核菌感染；不能排除結(jié)

9、核感染。陽性：曾有結(jié)核感染，并不一定現(xiàn)在患病。強陽性：活動性結(jié)核病可能,A、變態(tài)反應(yīng)尚未建立；B、免疫抑制如應(yīng)用皮質(zhì)激素或營養(yǎng)不良等,27,PPD--結(jié)核菌素試驗,PPD所含抗原為致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌及卡介苗菌株所共有，其結(jié)果受到卡介苗接種及其他分枝桿菌感染的影響，特異性較差。 當(dāng)出現(xiàn)免疫功能低下時可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，敏感性低。 免疫力正常的陰性有一定意義。強陽性有一定意義。有結(jié)核變態(tài)反應(yīng)、淋巴結(jié)核強陽

10、性多。 經(jīng)濟、簡便，可以用于流行病學(xué)大規(guī)模的篩查和普查，但存在著明顯的缺陷。,PPD試驗臨床價值,28,T-SPOT實驗,細(xì)胞免疫學(xué)檢查,T-SPOT試驗原理,結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時會分泌多種細(xì)胞因子（IFN-γ）。因此，檢測效應(yīng)T淋巴細(xì)胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感染者的診斷。既用抗體捕獲培養(yǎng)中細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點顯色方式將其表現(xiàn)出來。刺激抗原：ES

11、AT-6蛋白(早期分泌抗原靶6） 、CFP-10蛋白（培養(yǎng)濾液蛋白）由結(jié)核分枝桿菌特有的RD1基因編碼，可刺激活化的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素。 RD1基因在BCG以及大部分環(huán)境分枝桿菌中缺失。,29,T-SPOT試驗,30,T-SPOT步驟,31,T-SPOT靈敏度,,靈敏度基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結(jié)核患者中有很高的檢出率 美國FDA數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183)

12、 國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(624/655),32,結(jié)核桿菌,特異性高只針對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群敏感，與絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG）無交叉反應(yīng) 美國FDA數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306) 國內(nèi)臨床數(shù)據(jù)：特異性94.1%(478/508),33,PPD皮試與T-SPOT試驗,PPD皮試和T-SPOT試驗的比較,34,T-SPOT試驗結(jié)果解

13、釋,陰性結(jié)果提示患者體內(nèi)不存在針對結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞。假陰性結(jié)果：①感染階段不同；②少數(shù)免疫系統(tǒng)功能不全/疾?。虎蹖嶒灧钦２僮?。 陽性結(jié)果提示患者體內(nèi)存在針對結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞，患者存在結(jié)核感染。但是否是活動性結(jié)核病，需結(jié)合臨床癥狀和其它檢測指標(biāo)綜合判斷。假陽性結(jié)果：① 4種環(huán)境分枝桿菌感染時：M.kansasii（堪薩斯）、M.szulgai（蘇氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）

14、減少了醫(yī)生主觀因素對檢測結(jié)果的影響; 故雖然檢測儀器昂貴，操作相對較為復(fù)雜，但仍可視為進行結(jié)核病早期診斷的較為理想的手段。,35,非血液樣本檢測,T-SPOT可通過一些體液成功地診斷出活動性結(jié)核：支氣管肺泡灌洗液（“BAL”）（肺部）腦脊髓液（“CSF”）（中樞神經(jīng)系統(tǒng)）胸腔積液（肺部周圍）腹膜液（腹腔）非血樣本的T-SPOT結(jié)果很強的話（即存在大量的結(jié)核效應(yīng)T細(xì)胞）,揭示在這個器官或部位存在活動性結(jié)核非血樣本中不存在結(jié)

15、核效應(yīng)T細(xì)胞，說明這個器官或部位沒有活動性結(jié)核,36,各國對潛伏感染風(fēng)險人群的篩查指南,37,小結(jié),03,,,,,小結(jié),結(jié)核病診斷金標(biāo)準(zhǔn)：抗酸桿菌培養(yǎng)--陽性病理結(jié)果--陽性,輔助手段：影像學(xué)、分子生物學(xué),結(jié)核病在臨床上仍不容忽視，但診斷仍存在難題,T-SPOT是結(jié)核病早期診斷的較為理想的手段,39,參考文獻,韋海旭，席薇蓮，陸利歡，陳健.γ-干擾素釋放分析T-SPOT．TB在結(jié)核性疾病中的診斷價值.臨床肺科雜志.2012,17(

16、8):1439-1440 張麗帆，劉曉清.γ干擾素釋放分析T-SPOT.TB診斷結(jié)核感染臨床應(yīng)用進展.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報.2009,4:506-510中華人民共和國衛(wèi)生部，肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)，2008-08-01 Childhood tuberculosis treatment remains imprecise scienceNature MedicineVolume:17,Page:116011 October 2011.Co