花椰菜抗黑腐病相關(guān)基因的克隆及其在抗病育種中的應(yīng)用.pdf

1、花椰菜是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種中以花球?yàn)楫a(chǎn)品的一個(gè)變種，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但在栽培過(guò)程中，黑腐病的大流行會(huì)使蔬菜品質(zhì)嚴(yán)重下降，造成大幅度減產(chǎn)，使得針對(duì)該病成因及預(yù)防的研究成為科學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)。但是目前對(duì)植物抗黑腐病的研究進(jìn)展主要集中在該病的遺傳規(guī)律，以及對(duì)致病菌侵染的應(yīng)答模式等方面，而在分子水平上對(duì)于抗黑腐病基因的研究卻很少。本論文通過(guò)篩選抗黑腐病基因相關(guān)分子標(biāo)記，同時(shí)結(jié)合電子克隆技術(shù)尋找候選的抗病基因，該研究對(duì)推進(jìn)防治黑腐病的進(jìn)程具有

2、重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本文以花椰菜抗感黑腐病一對(duì)近等基因系為實(shí)驗(yàn)材料，在抗黑腐病基因篩選的研究中，首次將ISSR分子標(biāo)記與電子克隆技術(shù)相結(jié)合，獲得一個(gè)與花椰菜抗黑腐病相關(guān)候選基因BRR-C，然后采用Southern雜交技術(shù)證明了BRR-C在抗、感花椰菜黑腐病材料中的多態(tài)性。進(jìn)一步將RT-PCR技術(shù)與RQ-PCR技術(shù)相結(jié)合，相應(yīng)于菌體脅迫前后以及時(shí)間長(zhǎng)度的變化，在抗、感花椰菜黑腐病材料中觀察到與預(yù)期相符的BRR-C表達(dá)趨勢(shì)，從而推測(cè)BR

3、R-C很可能參與了花椰菜抗黑腐病的防衛(wèi)機(jī)制，并對(duì)BRR-C可能參與的抗病機(jī)制進(jìn)行了探討。同時(shí)根據(jù)ISSR分子標(biāo)記及BRR-C序列設(shè)計(jì)了三對(duì)SCAR標(biāo)記引物，這對(duì)分子標(biāo)記技術(shù)輔助抗性育種的應(yīng)用具有重要意義。主要結(jié)果如下：
　　 ⑴應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，從近等位基因系材料中篩選得到了兩條差異明顯且重復(fù)性好的條帶，即ISSR21200，ISSR17800。經(jīng)過(guò)克隆測(cè)序后分析發(fā)現(xiàn)，ISSR17800與Brassica napus v

4、at.napus的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AJ245479)具有93％的同源性；而ISSR21200與擬南芥中的一段EST序列(AK228713，hypothetical protein)有85％的同源性。
　　 ⑵利用分子標(biāo)記ISSR21200作為種子序列，通過(guò)電子克隆技術(shù)獲得抗黑腐病候選基因BRR(black rot resistance candidate genes)。隨后依據(jù)BRR設(shè)計(jì)特異引物，在花椰菜基因組中分離到1

5、條候選基因BRR-C(black rot resistance candidategenes of cauliflower)，經(jīng)過(guò)克隆測(cè)序后分析發(fā)現(xiàn)，該序列全長(zhǎng)2204bp，包含2個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，共編碼484個(gè)氨基酸，與擬南芥逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的逆轉(zhuǎn)錄酶基因存在高同源性。
　　 ⑶采用Southern雜交技術(shù)，將BRR-C與抗、感花椰菜黑腐病基因組進(jìn)行雜交，結(jié)果表明BRR-C在抗、感病性材料中存在明顯多態(tài)性，并且在花椰菜基因組中

6、以低拷貝形式存在。
　　 ⑷依據(jù)BRR-C含有的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果表明BRR-C在脅迫條件下表達(dá)豐度提高。隨后以不同時(shí)間段XCC脅迫的近等位基因系為材料，進(jìn)行RQ-PCR(real-time-quantimtive PCR)分析，結(jié)果表明花椰菜中BRR-C的表達(dá)確實(shí)受到XCC的誘導(dǎo)。因此，我們認(rèn)為BRR-C參與了花椰菜抗黑腐病的防衛(wèi)機(jī)制，這為進(jìn)一步克隆花椰菜抗黑腐病基因提供了可靠的候選基因。