棉花抗枯萎病相關基因的克隆.pdf

1、目的：棉花枯萎病是一種在世界范圍內(nèi)普遍流行的土傳的真菌性病害，嚴重影響棉花生產(chǎn)，新疆是我國唯一的海島棉生產(chǎn)基地，也是我國海島棉枯萎病流行區(qū)。大量研究表明，選育抗病品種是解決棉花枯萎病最為經(jīng)濟有效的措施。分子生物學技術和生物信息學的不斷完善和應用為棉花抗枯萎病品種的選育提供了新的途徑。本研究采用cDNA-AFLP技術結(jié)合RACE技術，從棉花抗病資源中挖掘抗病相關基因，研究基因的表達特性，初步分析基因的功能，為進一步闡明棉花抗病的分子機制及

2、抗枯萎病棉花品種選育奠定基礎。
　　方法：本研究以高抗枯萎病的陸地棉品種中棉所12號為材料，將材料水培至第三片真葉展平時進行接菌處理，以未接菌材料為對照，利用cDNA-AFLP技術獲得差異基因片段，對差異片段進行同源性分析，結(jié)合RACE技術，獲得基因的全長cDNA序列；采用實時熒光定量RT-PCR技術對基因進行時空表達特性分析，并構(gòu)建過表達載體和干擾載體為研究該基因的功能提供基礎條件。
　　結(jié)果：1：本研究利用cDNA-AF

3、LP技術對棉花cDNA進行差異片段分離，得到94個差異片段，選取48個差異片段進行克隆及測序，獲得25條差異片段，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行序列信息比對，結(jié)果顯示：21條基因片段在基因庫中有同源序列，并且已知生物學功能；3條基因片段在基因庫中有同源序列但功能未知；1條基因片段在基因庫中沒有同源序列。
　　2：通過對差異片段的同源性比對，選取其中一條差異片段，利用RACE技術，對其進行全長克隆，獲得全長后發(fā)現(xiàn)該基因與NBS-LRR

4、類的抗病基因同源性很高，編碼框全長為1941bp，編碼647個氨基酸，分子量為74.08KDa，等電點為5.35。將其命名為GhNBS1。
　　3：通過實時熒光定量PCR技術對該基因在棉花不同器官和不同發(fā)育時間的表達進行分析，從表達特征來看，該基因?qū)γ藁菸【{迫敏感，在棉花根、莖和葉中均表達，在葉片中表達量最高，莖中次之，根中表達量最低。在葉片中基因的表達量隨著時間的延長而增加，在6h時達到高峰，之后降低，在48h時達到最低值