旋毛蟲成蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑免疫學及生物活性研究.pdf

1、旋毛蟲病是一種嚴重威脅公共衛(wèi)生安全的重要人獸共患病，感染者主要是通過食入生的或者未加工完全的含有感染性幼蟲的肉而感染。旋毛蟲病一直未得到根本上的控制，近些年來感染率又有反彈的趨勢。
　　絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPI)是結構上保守的蛋白質家族，廣泛存在于多種生物體內，是主要的調節(jié)蛋白之一。在多種生理學和細胞學功能上發(fā)揮重要作用，如凝血、炎癥反應、細胞凋亡等。在多種寄生蟲感染過程中，SPI在蟲體與宿主相互作用中發(fā)揮重要作用。
　　

2、本試驗提取旋毛蟲5日齡成蟲總RNA，根據(jù)GenBank中登陸的旋毛蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑基因（登錄號:EU263307.1）設計引物。通過RT-PCR方法獲得蟲體cDNA，PCR方法獲得旋毛蟲成蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑(TsAdSPI)基因。將獲得的目的基因通過T4連接酶與克隆載體pMD18-T連接，進行雙酶切、PCR及測序鑒定。將鑒定正確目的片段與表達載體pET-28a連接，經(jīng)過雙酶切、PCR及測序鑒定正確岳，用IPTG對目的蛋白進行誘導表

3、達。SDS-PAGE結果顯示，目的蛋白分子量為44kDa，以包涵體形式存在。對誘導的時間、溫度、IPTG濃度優(yōu)化結果顯示，誘導時間為5h，溫度為37℃，IPTG濃度為1.0mmol/L時TsAdSPI重組蛋白表達量最大。
　　對TsAdSPI重組蛋白進行純化，用弗氏佐劑乳化目的蛋白之后背部六點分三次免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體。免疫之后分離免疫血清，Western-blot方法對TsAdSPI重組蛋白的免疫原性進行分析，結果顯

4、示制備的多克隆抗體可以有效識別TsAdSPI重組蛋白且條帶單一。采用間接ELISA方法對制備的多克隆抗體效價進行檢測，結果顯示制備的多克隆抗體效價高達1∶51200。以上實驗結果表明本研究通過原核表達系統(tǒng)得到的TsAdSPI重組蛋白具有良好的免疫原性，可以誘導機體產(chǎn)生高效且特異性較高的免疫應答。分離感染旋毛蟲5天的小鼠血清，Western-blot分析顯示TsAdSPI重組蛋白可以被分離得到的血清所識別，證明TsAdSPI重組蛋白具有良

5、好的反應原性。
　　對旋毛蟲5日齡成蟲及肌幼蟲的TsAdSPI重組蛋白免疫組織化學方法定位發(fā)現(xiàn)，在兩個時期蟲體的體內和體表均發(fā)現(xiàn)有TsAdSPI重組蛋白的分布。運用發(fā)色底物法對TsAdSPI重組蛋白的抑制活性進行分析，結果顯示TsAdSPI重組蛋白可以有效抑制胰蛋白酶、彈性蛋白酶、糜蛋白酶活性，抑制率分別為88％、72％、42％。
　　本試驗研究結果表明，TsAdSPI重組蛋白可以誘導機體產(chǎn)生良好的免疫反應，具有良好的免疫原