孕激素(DHP)調(diào)控魚類雌性性別分化過程的機制研究.pdf

1、魚類在脊椎動物系統(tǒng)演化過程中起著承前啟后的地位。因此，對魚類性別決定與分化機制的研究，是整個脊椎動物性別決定與分化的重要組成部分。與哺乳動物、鳥類等高等脊椎動物相比，魚類性別決定與分化機制具有原始性、易變性和多樣性。它仍然以遺傳基因為性別決定和分化的基礎(chǔ)，同時也會受到某些外界環(huán)境因素的影響，故魚類的性別決定與分化過程益顯復(fù)雜。孕激素（DHP）是包括尼羅羅非魚在類的大多數(shù)硬骨魚的配子成熟激素，它作為一種主要的性類固醇激素，僅在配子成熟時期

2、的體細胞中合成。主要是促進配子的最終成熟以及排精（卵）過程。通過離體和在體研究，已經(jīng)證明了DHP信號通路在鱈魚(Gadus morhua)、大西洋鮭魚(Salmon salar)、日本鰻鱺(Anguilla japonica)等魚類的精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。但是到目前為止，DHP在硬骨魚類雌性性別分化過程中的作用還鮮為人知。因此，本實驗以尼羅羅非魚為實驗材料，通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除核受體pgr基因以及用孕激素受體拮抗劑R

3、U486阻斷DHP信號通路等實驗，深入研究DHP對雌性性別分化過程的調(diào)控機制，最終加深我們對DHP在尼羅羅非魚甚至硬骨魚類早期性別分化過程中的作用認識。本論文的主要研究結(jié)果如下：
　?。?）利用魚類孕激素（DHP）受體的拮抗劑RU486從孵化后5天（days after hatching。dah）開始處理基因型為 XX的雌性尼羅羅非魚，分別在20、40、90、120dah取材檢測。與正常的雌雄對照相比，RU486的持續(xù)處理不僅阻遏

4、了卵子發(fā)生過程，還降低性腺中雌性通路基因的表達和血清中雌激素水平。相反，RU486處理激活了雄性通路基因的表達。這暗示：魚類孕激素（DHP）直接或間接通過雌激素參與生殖細胞的減數(shù)分裂起始以及性別分化過程。
　　（2）運用RU486從5dah開始處理雌性尼羅羅非魚，分別到20、40、90dah停止處理，接著正常飼養(yǎng)到120dah取材檢測。令人驚奇的是，此時的性腺發(fā)育成具有生理功能的精巢。我們推測性逆轉(zhuǎn)的原因可能是由于體細胞的雄性化以

5、及內(nèi)源性DHP的恢復(fù)所致。
　?。?）在用RU486阻斷DHP信號通路的同時，嘗試分別利用一定劑量的外源DHP/E2進行回救。額外補償DHP不能回救RU486對性腺發(fā)育的影響。同時發(fā)現(xiàn)，額外補償E2的性腺組織觀察結(jié)果顯示：E2能成功誘導(dǎo)RU486處理的雌魚恢復(fù)卵巢分化。不過有趣的是，在用RU486阻斷DHP這條信號通路時，E2不能完全的誘導(dǎo)雌性的發(fā)育。因為卵巢體細胞中foxl2和cyp19a1a的RNA表達水平仍然顯著性低于正常雌

6、魚對照。我們認為：在RU486處理魚中，外源E2誘導(dǎo)的卵子發(fā)生可能是直接作用于生殖細胞產(chǎn)生的結(jié)果，并不是通過內(nèi)源性E2的產(chǎn)生這條途徑，當(dāng)然具體的機制還需要進一步的研究?？偟膩碚f，在這些數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)之上，我們提出“雌激素和孕激素（DHP）協(xié)同調(diào)控雌性發(fā)育”的觀點。
　?。?）利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功在尼羅羅非魚建立孕激素核受體pgr的純合敲除體系。組織學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在性別分化早期，純合敲除的雌雄魚與正常對照相比，無明顯差異