禽傳染性喉氣管炎病毒gJ蛋白的原核表達及單克隆抗體的研制與標(biāo)準(zhǔn)抗原抗體的制備.pdf

1、傳染性喉氣管炎(Infectious Laryngotracheitis，ILT)是由皰疹病毒科傳染性喉氣管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis virus，ILTV)引起的雞的一種呼吸道傳染病。主要臨床癥狀為咳出含有血液的滲出物并伴發(fā)高死亡率，引起流鼻涕、結(jié)膜炎、體重和產(chǎn)蛋下降。本病自1925年首次報道以來，現(xiàn)已遍布各養(yǎng)禽國家和地區(qū)，我國主要呈地方流行。本研究利用原核表達系統(tǒng)成功表達重組蛋白His-gJ，并

2、研制了3株針對ILTV gJ蛋白的單克隆抗體。同時以ILTV王崗(WG)株免疫SPF雞制得多抗血清，對ILTV抗原和抗血清進行一系列標(biāo)定，獲得了ILTV的標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)血清，為ILTV的診斷和防治提供了有效的方法和材料。
　　1、抗禽傳染性喉氣管炎病毒gJ蛋白原核表達與單克隆抗體的研制
　　根據(jù)GenBank中已發(fā)表的傳染性喉氣管炎病毒gJ全基因序列設(shè)計gJ編碼區(qū)(445-745位氨基酸)的特異性引物，上下游引物分別引入酶切

3、位點BamHⅠ和XhoⅠ，以傳染性喉氣管炎病毒W(wǎng)G株基因組為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物克隆并連接到原核表達載體pET-32a(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-gJ并轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，獲得大小為55KD的重組蛋白His-gJ。并利用親和柱對重組蛋白His-gJ進行純化，SDS-PAGE和Western-Blot結(jié)果表明，融合蛋白His-gJ具有良好的抗原性;利用獲得的ILTV重組蛋白His-gJ為抗原，建立

4、檢測ILTV抗體的ELISA方法。
　　以ILTV WG株全病毒作為免疫原，按照常規(guī)程序免疫6-8周齡Balb/c小鼠，取脾細(xì)胞與S/P20細(xì)胞融合，利用重組蛋白His-gJ進行間接酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)篩選陽性細(xì)胞株，最終得到3株分泌針對ILTV gJ蛋白單克隆抗體的陽性細(xì)胞株，分別命名為:ILTV-gJ-4C6、ILTV-gJ-5B8、ILTV-gJ-6B6。Western-Blot與間接免疫熒光(IFA)鑒定結(jié)果表明

5、，所得三株單抗均能與ILTV WG株天然病毒發(fā)生特異性反應(yīng)。3株單克隆抗體的抗體亞類均為IgG1，Kappa鏈。利用親和層系技術(shù)分別純化了3株單抗腹水，獲得了高純度的單克隆抗體，為今后建立ILTV檢測技術(shù)提供了良好的試劑材料。
　　2、禽傳染性喉氣管炎病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原及血清的制備
　　本研究用SPF雞胚擴增禽傳染性喉氣管炎病毒W(wǎng)G株，對收集的傳染性喉氣管炎病毒進行了病毒含量測定分析，結(jié)果該材料中病毒為10-4.9ELD50/0.

6、2mL。血凝試驗(HA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及ELISA實驗技術(shù)進一步鑒定了該病毒無傳染性法氏囊病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、小鵝瘟病毒(GPV)、馬立克氏病病毒(MDV)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、雞產(chǎn)蛋下降綜合癥(EDS-76)、禽白血病病毒(ALV)等外源性病毒污染，無菌檢驗也證明該病毒材料無菌生長、無支原體污染。將該ILTV全病毒抗原經(jīng)一系列標(biāo)定，加入1％BSA凍存保護劑，分裝，凍干，并

7、進行物理性狀和無菌檢驗及支原體污染檢驗，最后獲得了ILTV的標(biāo)準(zhǔn)抗原。
　　將ILTV WG株多次免疫SPF雞，制得了抗ILTV多抗血清，用重組融合蛋白gJ進行間接ELISA檢測，結(jié)果表明該血清的ELISA效價為1∶1200。利用HI、IFA實驗技術(shù)鑒定該多抗血清抗體，證明該血清與上述其他病毒多抗血清無交叉反應(yīng)性，僅與ILTV反應(yīng)，特異性良好;無菌檢驗、支原體檢驗合格。經(jīng)一系列標(biāo)定后，在血清中加入萬分之一的硫柳汞防腐劑，分裝，凍干