抗-牛朊蛋白單鏈抗體檢測系統(tǒng)的構(gòu)建、表征與應(yīng)用.pdf

1、朊病毒(prp<'sc>)是一種新型蛋白質(zhì)感染因子，能夠引起人和動物的可轉(zhuǎn)移性神經(jīng)退化疾病，如牛海綿狀腦病(BSE)(或稱瘋牛病)和人的新型克雅氏病(nvCJD)。BSE已在世界范圍內(nèi)對養(yǎng)牛業(yè)和世界經(jīng)濟(jì)造成了巨大損失，由于受污染的牛制品可將瘋牛病傳染給人類，給人類健康構(gòu)成了巨大威脅，因此建立特異、靈敏的牛朊病毒檢測方法十分重要。 免疫學(xué)檢測是牛朊病毒主要的檢測方法，目前，用于檢測的抗體為單克隆抗體。本研究嘗試建立單鏈抗體介導(dǎo)的夾

2、心蛋白芯片用于牛朊蛋白的檢測。要獲得抗牛朊蛋白單鏈抗體，首先構(gòu)建噬菌體抗體庫。由于牛和小鼠的PrP基因同源性約90％，為了避免出現(xiàn)免疫耐受，采用牛朊蛋白融合蛋白免疫小鼠。通過PCR和DNA重組構(gòu)建了牛朊蛋白基因的原核表達(dá)載體，在基因水平上構(gòu)建了硫氧還蛋白(TrxA)基因和牛朊蛋白基因的融合基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行了IPTG誘導(dǎo)表達(dá)硫氧還蛋白-牛朊蛋白融合蛋白(TrxA-bPrP<'c>)。Western blot分析表明該融合蛋白具有結(jié)

3、合牛朊蛋白單克隆抗體的活性。采用TrxA-bPrP<'c>融合蛋白免疫小鼠成功突破了小鼠免疫耐受，誘導(dǎo)了抗牛朊蛋白抗體。通過PCR從牛朊蛋白融合蛋白免疫的小鼠脾臟B細(xì)胞中擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因片段(V<,H>，V<,L>)，然后通過OverlapPCR擴(kuò)增抗體可變區(qū)基因，將體外組裝的scFv基因片段克隆入噬菌體展示載體pCANTAB 5E，通過“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的富集過程，從噬菌體抗體庫中篩選出針對牛朊蛋白特異的單鏈抗體Z163、Z186

4、和Z1030。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了四個單鏈抗體融合蛋白：Z186-L-SBP、Z163-L-SBP、 Z163-Fc和Z1030-Fc，采用WesternBlot、SPR和Sandwich ELISA方法對其特性進(jìn)行了研究。Western Blot結(jié)果表明Z186-L-SBP、Z163-L-SBP、Z1030-Fc和Z163-Fc可特異識別重組牛朊蛋白核心區(qū)片段的線性表位；用夾心ELISA對4個單鏈抗體融合蛋白及抗牛朊蛋白單克隆抗體KG9進(jìn)

5、行配對實驗，Z186-L-SBP/Z163-Fc和Z163-L-SBP/KG9配對顯示明顯的陽性結(jié)果：用SPR方法測定了Zl63、Zl63-L-SBP、Zl63-Fc和Zl86-L-SBP的親和力，其平衡解離常數(shù)(KD)分別為8.82×10<'-8>M、4.11×10<'-8>M、8.10×10<'-9>M和3.24x10<'-8>M。單鏈抗體融合蛋白Zl63-L-SBP親和力是單鏈抗體Zl63的2.2倍，單鏈抗體融合蛋白Zl63-Fc

6、親和力是單鏈抗體Zl63的11倍，親和力有明顯的提高。Z186-L-SBP中SBP與streptavidin的平衡解離常數(shù)(KD)為5.97×10<'-9> M(5.97 nM)，Keefe等(2001)測得的未融合SBP的KD為2.5×10<'-9>M(2.5 mM)，親和力略有下降，但基本上保持了原SBP的親和力，可以用于作捕獲抗體進(jìn)行定向固定。 在上述配對實驗的基礎(chǔ)上發(fā)展了兩種夾心抗體芯片：一種是基于單克隆抗體．單鏈抗體融

7、合蛋白的夾心抗體芯片。將單克隆抗體KG9共價固定在多聚賴氨酸修飾的片基上作為捕獲抗體；單鏈抗體融合蛋白Z163-L-SBP作為檢測抗體，用偶聯(lián)有streptavidin的量子點作為檢測探針，與streptavidin親和肽特異結(jié)合，該方法具有很高的特異性和靈敏度，檢測限可達(dá)lpg／mL重組牛朊蛋白，并可以檢測鼠腦中天然朊蛋白；另一種是基于兩個單鏈抗體融合蛋白的夾心抗體芯片，將單鏈抗體融合蛋白Z186-L-SBP，通過SBP將Z186-L