對蝦白斑綜合癥病毒囊膜蛋白基因vp26和vp28的克隆及在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、對蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是全球?qū)ξr的主要病原之一,對全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的損失。目前在分子水平WSSV的感染和致病機(jī)理還未闡明,結(jié)構(gòu)和功能基因的分析以及致病機(jī)理研究是目前WSSV研究的熱點(diǎn)。WSSV是一種具有囊膜的雙鏈DNA病毒,VP26和VP28是它的兩個(gè)主要的囊膜蛋白,其中VP28已被初步證明在病毒吸附與入侵中起著關(guān)鍵作用,VP26研究較少,但它和VP28是同源蛋白。本研

2、究成功實(shí)現(xiàn)了vp26和vp28基因在畢赤酵母中的分泌表達(dá),為以后制備特異性抗體,開展WSSV的快速有效檢測和WSSV亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ),同時(shí)為探索外源基因的真核表達(dá)積累了經(jīng)驗(yàn)。
　　 ⑴vp26、vp28基因的克隆:根據(jù)GenBank庫中對蝦白斑病毒的全基因組序列,分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增該病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白基因vp26、vp28的相應(yīng)引物,以從發(fā)病的斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)中提取的總DNA為模板,利用PCR技術(shù)對目

3、的基因進(jìn)行了擴(kuò)增,獲得長度均為615bp的2個(gè)基因片段,片段大小與預(yù)期一致。將目的片段與pGEM-T-easy載體連接,導(dǎo)入大腸桿菌DH5α,獲得陽性重組子pT-vp26、pT-vp28。目的片段測序結(jié)果與GenBank庫中公布的vp26、vp28基因序列同源性達(dá)到了99％以上,說明已成功獲得vp26和vp28基因片段,且基因在進(jìn)化上非常保守。
　　 ⑵重組蛋白在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的免疫活性:將vp26、vp28克隆

4、至畢赤酵母穿梭表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K,構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9K-VP26、pPIC9K-VP28,經(jīng)BglⅡ線性化酶切,電穿孔將其整合到畢赤酵母宿主菌GS115。重組畢赤酵母經(jīng)PCR鑒定和G418篩選后進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物分別進(jìn)行SDS-PAGE、Western blot和ELISA分析,結(jié)果表明:所得到的vp26和vp28基因都能夠進(jìn)行分泌表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物大小均為31kDa左右;Westernblot和ELISA結(jié)果表明鼠抗血清