對蝦白斑綜合征病毒囊膜蛋白VP28和VP26與細胞穿膜肽的融合蛋白在畢赤酵母中的組成型表達研究.pdf

1、白斑綜合征病毒(WSSV)是危害全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)最嚴(yán)重的病原體之一，給對蝦養(yǎng)殖帶來了巨大危害。雖然目前還沒有有效地控制該病毒蔓延的方法，但是隨著WSSV基因組測序的完成，該病毒結(jié)構(gòu)基因的組成與功能越來越清晰，這為研究病毒侵染對蝦細胞的機制奠定了基礎(chǔ)。在研究病毒侵染對蝦機制的過程中，研究者們發(fā)現(xiàn)病毒的某些囊膜蛋白在啟動病毒感染的發(fā)生或介導(dǎo)病毒的侵入方面起著重要作用，其中VP28和VP26就是兩種非常重要的病毒囊膜蛋白。越來越多的研究表明將一

2、些重要的病毒囊膜蛋白導(dǎo)入對蝦體內(nèi)后，能夠增強對蝦抗WSSV侵染的能力，而這一研究結(jié)果促進了WSSV蛋白質(zhì)亞單位疫苗的誕生。然而蛋白亞單位疫苗的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，在通過口服的方式免疫對蝦時，由于無法以蛋白質(zhì)大分子的形式被吸收，而達不到很好的免疫效果，因此需要尋求能夠攜帶大分子貨物穿越細胞膜的載體—細胞穿膜肽(CPPs)的幫助。
　　本研究首先利用畢赤酵母表達系統(tǒng)成功表達了CPPs-GFP的融合蛋白，所選用的CPPs分別是TAT、R9和P

3、enetratin，并證明CPPs可以攜帶蛋白質(zhì)GFP（綠色熒光蛋白）活體穿過克氏原螯蝦的腸系膜進入到蝦體的血液循環(huán)中，然后到達各個組織。在此基礎(chǔ)上，再次利用畢赤酵母表達系統(tǒng)成功分泌性表達了VP28和VP26與CPPs的融合蛋白，為WSSV蛋白質(zhì)亞單位疫苗規(guī)?；a(chǎn)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。具體研究內(nèi)容與結(jié)果如下:
　　1.TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP融合蛋白在畢赤酵母中成功分泌性表達。首先，提取pTracer

4、-CMV2質(zhì)粒作為擴增GFP基因的模板，并且根據(jù)TAT、R9和Penetratin的氨基酸序列利用Codon Adaptation Tool軟件設(shè)計了適合在酵母中表達的核酸序列，通過引物懸掛法將這些核酸序列添加到了GFP基因的5'端。選擇表達載體pGAPZαA的EcoRⅠ和XbaⅠ雙限制性內(nèi)切酶酶切位點，因此在目的基因的兩端也分別添加了EcoRⅠ和XbaⅠ的核酸序列。然后，將酶切后的目的基因插入到表達載體中，轉(zhuǎn)化TOP10大腸桿菌感受態(tài)

5、細胞，經(jīng)博萊霉素(Zeocin)抗性篩選陽性克隆，通過測序后可知重組表達載體成功構(gòu)建。其次，重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BlnⅠ(AvrⅡ)酶切線性化之后，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33感受態(tài)細胞，經(jīng)Zeocin抗性篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子。最后，SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳檢測重組酵母表達上清目的蛋白的表達情況，結(jié)果表明本研究成功利用畢赤酵母表達系統(tǒng)表達了GFP、TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP蛋白，分子量大小約在29kDa。<

6、br>　　2.檢測CPPs攜帶蛋白質(zhì)分子穿膜的效果。實驗室小規(guī)模發(fā)酵獲得GFP、TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP目的蛋白，經(jīng)冷凍干燥后獲得蛋白上清冷凍干粉，接著用PBS配制成10mg/ml的蛋白母液。用克氏原螯蝦作為實驗動物，活體灌喂等體積等濃度的GFP、TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP的蛋白溶液，同時灌喂等體積的PBS作為陰性對照。灌喂兩小時后分別取樣鰲蝦的中腸、心臟和肌肉組織進行冷

7、凍切片分析，利用熒光倒置顯微鏡可以觀察到，灌喂TAT-GFP、R9-GFP和Penetratin-GFP的蛋白溶液組的鰲蝦的腸道、心臟和肌肉可以看到明顯的熒光，而灌喂GFP蛋白液的鰲蝦僅在腸道中看到微弱的熒光，陰性對照沒有觀察到任何熒光。
　　3.VP28-TAT/R9、VP26-TAT/R9和GFP-TAT/R9融合蛋白在畢赤酵母中組成型分泌表達。根據(jù)Genbank中WSSV的基因序列設(shè)計引物，以WSSV粗提液為模板進行普通PC

8、R擴增，得到VP28和VP26基因。同樣用引物懸掛法將TAT和R9的核酸序列添加到VP28、VP26和GFP基因的3'端，并且添加EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點。目的基因經(jīng)過雙酶切、與表達載體連接、線性化、轉(zhuǎn)化畢赤酵母和篩選重組酵母這一系列分子克隆操作過程后，成功得到了重組酵母。SDS-PAGE電泳分析畢赤酵母表達上清的目的蛋白，經(jīng)考馬斯亮藍R-250染色發(fā)現(xiàn)GFP-TAT和GFP-R9表達上清有明顯條帶，蛋白分子量大小在29kDa左右，