懷菊花種質資源玻璃化超低溫保存技術研究.pdf

1、懷菊花[Huaiqing chrysanthemum(Dendranthema morifolium)]是“四大懷藥”之一,主產(chǎn)于河南溫縣、武陟、博愛(古為懷慶府所轄,故名),兼具觀賞、藥用、食補三大功能。但目前懷菊花種質資源仍采用大田種植保存的方法,方式單一,加上其自身的特點,菊花屬于異花授粉,大田種植使其純度不能保證,長期以來種質混雜,珍貴的種質資源流失嚴重。20世紀術發(fā)展起來的超低溫保存技術,是目前長期穩(wěn)定保存植物種質資源的唯一可

2、行的好方法,它可以節(jié)省空間,避免繼代、病蟲害和氣候等因素造成的種質丟失,并且設備簡單,操作簡便。基于此,我們開展了懷菊花玻璃化法超低溫保存種質的技術研究。取得了如下研究結果:
　　 1.建立了懷菊花的快繁技術體系。懷菊花試管苗可通過腋生枝型和多芽體發(fā)生型兩種途徑進行繁殖,腋生枝型的最佳快繁培養(yǎng)基為MS+6-BA0.2 mg·L-1+NAA0.2 mg·L-1:多芽體發(fā)生型(帶芽莖段和葉片)最佳的培養(yǎng)基為MS+6-BA1 mg·L

3、-1+NAA2 mg·L-1:試管苗生根的最佳培養(yǎng)基為MS+PP3330.5 mg·L-1。
　　 2.建立了玻璃化法超低溫保存懷菊花種質資源的技術體系。繼代培養(yǎng)40 d的試管苗,于4℃低溫下鍛煉7 d,在無菌條件下切取0.5 cm左右的帶芽莖段,采用MS培養(yǎng)基添加Glu0.24 mol·L-1+Gly0.4 mol·L-1作為預培養(yǎng)基,在4℃下恒定培養(yǎng)3 d,然后將材料用60％PVS2做裝載液在室溫下裝載20 min,然后用改

4、良的PVS2(Gly30％+EG15％+DMSO10％)0℃下脫水60 min,迅速投入液氮保存;在液氮中至少保存1 d后,立即將材料放入40℃水浴中快速化凍1～3 min,化凍后以MS基本培養(yǎng)基添加1.0mol·L-1和1.2 mol·L-1葡萄糖的梯度洗滌,每次10 min,洗滌后轉入再生培養(yǎng)基(同快繁培養(yǎng)基)中,于暗處培養(yǎng)至15 d開始形成愈傷,30 d時轉到光下培養(yǎng),培養(yǎng)至7 d時愈傷開始轉綠,至25 d～30 d時芽開始形成,

5、60 d后可長成正常植株,成活率可達80％以上。
　　 3.對保存后的再生苗進行了穩(wěn)定性分析。與常溫苗相比,玻璃化超低溫保存后的懷菊花再生苗的平均莖節(jié)長、株高和葉片數(shù)增加值均沒有顯著差異;葉片的可溶性糖、可溶性蛋白和葉綠素含量也均沒有顯著的差異;而再生苗葉片的相對電導率、超氧陰離子和丙二醛含量顯著降低,SOD和POD活力增強,同工酶譜分析表明,二者的POD、SOD酶譜表現(xiàn)出高度的一致性,但個別譜帶的寬窄及亮度存在差異。以上說明,