黃瓜花藥培養(yǎng)及橙色果肉QTL分析和類胡蘿卜素合成酶基因定位研究.pdf

1、黃瓜（Cucumis sativusL.，2n=2x=14）是世界十大重要蔬菜作物，在世界各地廣泛栽植。由于遺傳背景狹窄，傳統(tǒng)育種效率低，單倍體育種和分子輔助育種(Marker-assisted selection, MAS)越來(lái)越受到重視。
　　 1黃瓜花藥培養(yǎng)研究
　　 花藥培養(yǎng)是獲得單倍體(Haploid)和雙單倍體(Double haploid, DH)的有效途徑，但有關(guān)黃瓜花藥培養(yǎng)的研究報(bào)道目前世界僅見三篇，最

2、近報(bào)道的花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)頻率為1.6胚/花藥和52單倍體/60花藥，花培效率仍需提高。本研究針對(duì)花藥培養(yǎng)過程中4℃低溫預(yù)處理、33℃熱激預(yù)培養(yǎng)、各培養(yǎng)階段培養(yǎng)基成分和基因型等關(guān)鍵因素，設(shè)計(jì)6個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)，進(jìn)行研究，結(jié)果如下：
　　 1)建立黃瓜花藥培養(yǎng)體系
　　 確立黃瓜花藥培養(yǎng)各階段培養(yǎng)基成分：胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+1.0mg/l6-BA+0.5mg/12，4-D+1.0mg/lKT+3％蔗糖+0.8％瓊脂；胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基

3、：MS+0.1mg/lNAA+3.0mg/16-BA+3％蔗糖+0.8％瓊脂；胚萌發(fā)培養(yǎng)基：MS+0.5mg/16-BA+6％蔗糖+1.2％瓊脂。
　　 明確影響黃瓜花藥培養(yǎng)的兩個(gè)關(guān)鍵因素：一是預(yù)處理和預(yù)培養(yǎng)溫度的選擇有賴于試材的生態(tài)型；二是胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-BA/NAA配合使用能夠成功誘導(dǎo)胚性愈傷分化成胚。
　　 2)獲得黃瓜花藥培養(yǎng)再生DH植株
　　 基于本試驗(yàn)建立的花藥培養(yǎng)體系，對(duì)31個(gè)不同基因型供試黃瓜進(jìn)

4、行花藥培養(yǎng)，16個(gè)材料產(chǎn)生胚性愈傷組織，其中3個(gè)基因型（寧佳1號(hào)、5117和4560）獲得再生植株。通過細(xì)胞學(xué)染色體計(jì)數(shù)、形態(tài)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析和分子標(biāo)記AFLP技術(shù)，確定120個(gè)寧佳1號(hào)再生植株中42個(gè)為雙單倍體，花藥培養(yǎng)比率為3胚/花藥和42DH/45花藥。
　　 2黃瓜橙色果肉QTL分析和類胡蘿卜素合成酶基因定位研究
　　 類胡蘿卜素在人類膳食營(yíng)養(yǎng)中扮演著極為重要的角色。西雙版納黃瓜（CsativusL.varxishua

5、ngbannanesis Qi et Yuan,2n=2x=14）成熟果果肉橙色，是培育富含類胡蘿卜素黃瓜品種的優(yōu)異種質(zhì)。本研究針對(duì)黃瓜果肉顏色和主要類胡蘿卜素含量進(jìn)行數(shù)量性狀位點(diǎn)（Quantitative trait loci， QTL）分析，為分子輔助育種(MAS)提供可靠的QTL標(biāo)記；同時(shí)對(duì)黃瓜類胡蘿卜素合成酶基因進(jìn)行定位，為在分子水平上明確黃瓜類胡蘿卜素合成途徑提供目的基因。主要研究?jī)?nèi)容結(jié)果如下：
　　 1)遺傳圖譜的構(gòu)

6、建
　　 以白色果肉黃瓜與橙色果肉黃瓜構(gòu)建兩個(gè)F2作圖群體（EC1×SWCC9和Gy7×USDA＃14），群體大小分別為79和143個(gè)單株。利用RAPD、SCAR、SSR、EST、SNP、AFLP和SSAP分子標(biāo)記繪制遺傳圖譜。最終獲得圖譜1包含74個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，全長(zhǎng)899.0cM,16個(gè)連鎖群，平均間距12.0cM;圖譜2包含23個(gè)位點(diǎn)，分作7個(gè)連鎖群，全長(zhǎng)230.9cM，平均間距9.6cM。
　　 通過比較兩張圖譜的

7、分子標(biāo)記信息，發(fā)現(xiàn)圖譜1的連鎖群(Linkage group， LG)6和圖譜2的LG3上存在一個(gè)共線性區(qū)域，包括3個(gè)顯性標(biāo)記（RAPD_AG13_1200、RAPD_P11_750和SNP_N8SNPG2H3_569）和1個(gè)共顯性標(biāo)記(SNP_AB14SNPG1H1_470/519)。
　　 2)果肉顏色QTL的分析
　　 基于兩個(gè)F2群體進(jìn)行黃瓜果肉顏色QTL分析，在群體1上檢測(cè)到4個(gè)控制中果皮顏色（Mesocarp

8、 color， MC）的QTL（mc6.1、mc6.2、mc9.1和mc15.1），和5個(gè)控制內(nèi)果皮顏色（Endocarp color，EC）的QTL（ec6.1、ec6.2、ec6.3、ec9.1和ec16.1）。在群體2上檢測(cè)到2個(gè)控制中果皮顏色的QTL（mc2.1、mc3.1）和3個(gè)控制內(nèi)果皮顏色的QTL(ec2.1、ec3.1、ec5.1)。
　　 其中位于圖譜1的2個(gè)果肉顏色QTL（mc6.1和ec6.1）與圖譜2的2

9、個(gè)果肉顏色QTL（mc3.1和ec3.1）位于兩個(gè)圖譜的共線性區(qū)域，說(shuō)明它們是在西雙版納黃瓜遺傳背景下穩(wěn)定出現(xiàn)的控制果肉顏色的QTL。
　　 3)果肉類胡蘿卜素含量的QTL分析
　　 對(duì)群體2單株的白色果肉和橙色果肉進(jìn)行高效液相色譜(High-performance liquidchromatography， HPLC)分析，明確β-胡蘿卜素和葉黃素是橙色果肉的主要類胡蘿卜素成分。
　　 利用群體2，對(duì)這兩種橙色

10、果肉中主要類胡蘿卜素含量進(jìn)行QTL分析，結(jié)果在圖譜2上檢測(cè)到1個(gè)控制中果皮β-胡蘿卜素含量的QTL位點(diǎn)（mdb2.1），2個(gè)控制內(nèi)果皮β-胡蘿卜素含量的QTL位點(diǎn)（edb2.1和edb3.1），2個(gè)控制中果皮葉黃素含量的QTL位點(diǎn)（mdx3.1和mdx3.2），和1個(gè)控制內(nèi)果皮葉黃素含量的QTL位點(diǎn)（edx3.1）。
　　 其中控制內(nèi)果皮β-胡蘿卜素含量的QTL位點(diǎn)（edb3.1）和控制中果皮葉黃素含量的QTL位點(diǎn)（mdx3.1

11、）與果肉顏色QTL（mc3.1和ec3.1）位于相同的區(qū)間內(nèi)。
　　 4)黃瓜類胡蘿卜素合成酶基因定位
　　 通過同源引物設(shè)計(jì)，最終將黃瓜類胡蘿卜素合成酶基因9-順式類胡蘿卜素雙加氧酶基因（9-cis-Epoxycarotenoid dioxygenase， NCED）以單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotide Polymorphism, SNP)標(biāo)記形式，定位于兩張圖譜共線性區(qū)域的不同位置。NCED的引入，沒有

12、改變圖譜原有序列。
　　 5)其他農(nóng)藝性狀的QTL定位
　　 針對(duì)群體1的子葉長(zhǎng)（Cotyledon length, CL）、下胚軸長(zhǎng)（Hypocotyllength， HL）、第一分枝節(jié)數(shù)(Node of first branch, NFB)、主莖直徑（Diameter of main stem， DM）、葉長(zhǎng)(Leaf length, LL)和葉寬(Leaf width， LW)等農(nóng)藝性狀，和群體2的果實(shí)長(zhǎng)(Frui