小梅山豬Ghrelin基因的克隆及其在生殖軸中的表達.pdf

1、生長激素釋放肽(Ghrelin)是生長激素促分泌素受體(GHS-R)的一種內(nèi)源性配體，1999年從小鼠和人的胃組織中成功分離并鑒定。Ghrelin對于下丘腦-垂體-性腺的內(nèi)分泌和旁分泌效應(yīng)為新近的研究熱點。本試驗以小梅山豬為實驗材料，研究Ghrelin在小梅山豬生殖軸的表達情況，旨在探究Ghrelin對動物繁殖性能的影響，從而為豐富動物生殖機理和早熟品種選種選育提供理論依據(jù)。
　　 根據(jù)NCBI上已發(fā)表的野豬Ghrelin mR

2、NA序列，在跨外顯子序列處設(shè)計一對引物。采集小梅山豬胃底腺組織，利用Trizol法提取總RNA，然后用RT-PCR法進行cDNA擴增，獲得了長度為341bp的目的片段。運用TA克隆法，將目的片段連接到pMD19-T載體上，通過藍白斑篩選和菌液PCR對重組質(zhì)粒進行鑒定。測序后進行比對發(fā)現(xiàn)，目的片段長度為341bp，其編碼的氨基酸與人Ghrelin氨基酸有3個氨基酸不同，同源性為89.3％；與沙鼠、小鼠、大鼠、犬也有3個氨基酸不同，同源性均

3、為89.3％；與牛、綿羊有6個氨基酸不同，同源性為78.6％；與雞有13個氨基酸不同，同源性為53.6％。這為分離、克隆小梅山豬Ghrelin基因全序列提供了可能。
　　 采集初生、初情期以及性成熟公小梅山豬垂體、下丘腦、睪丸、附睪和母小梅山豬垂體、下丘腦、卵巢、子宮組織，利用Trizol法提取總RNA。RT-PCR法對其進行組織表達譜研究，發(fā)現(xiàn)在上述組織中均有Ghrelin mRNA的表達，表明Ghrelin mRNA的表達在

4、小梅山豬上不具有組織特異性。
　　 利用實時熒光定量PCR法測定母小梅山豬生殖軸各組織中Ghrelin mRNA相對表達豐度變化。結(jié)果表明：根據(jù)性成熟生殖軸不同組織Ghrelin mRNA表達量分析，以性成熟小梅山豬卵巢Ghrelin mRNA表達量為校正樣本，表達量為1，下丘腦相對表達量為0.449，垂體相對表達量為0.316，與卵巢差異顯著(P＜0.05)，垂體與下丘腦之間差異不顯著(P＞0.05)；根據(jù)生長發(fā)育不同階段Gh