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1、β-1,3-葡聚糖酶是一類能夠特異作用于β-葡聚糖中β-1,3糖苷鍵的葡聚糖水解酶系。β-1,3-葡聚糖酶大體上可以分為兩類:外切β-1,3-葡聚糖酶(EC3.2.1.58)和內(nèi)切β-1,3-葡聚糖酶(EC3.2.1.6或EC3.2.1.39)。β-1,3-葡聚糖酶廣泛分布和存在于病毒、細(xì)菌、絲狀真菌、放射菌類、酵母、軟體動(dòng)物和高等植物中。在啤酒工業(yè)、飼料工業(yè)、醫(yī)療和植物抗病等方面有大量應(yīng)用。
嗜熱毛殼菌(Chaetomi
2、um thermophilum)是一種廣泛分布的嗜熱真菌,其生長上限溫度很高,產(chǎn)生的嗜熱酶在高溫條件下具有很高的活性和穩(wěn)定性,該菌在含有麥麩的培養(yǎng)基中,50℃條件下可以產(chǎn)生β-1,3-葡聚糖酶。目前已從該菌中分離純化了熱穩(wěn)定的蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和纖維素酶等,但未見該菌β-1,3-葡聚糖酶的完整報(bào)道。
本研究以嗜熱毛殼菌為研究材料,根據(jù)已得到β-1,3-葡聚糖酶的中間片段,設(shè)計(jì)特異引物,通過RACE-PCR和熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR
3、等方法,克隆了該β-1,3-葡聚糖酶的編碼基因glu-n,全長cDNA2765bp,包含一個(gè)由786個(gè)氨基酸組成的開放閱讀框。該基因cDNA已在GenBank中注冊(cè),登錄號(hào)為GQ149728。
glu-n基因和酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K用SnaBⅠ和AvrⅡ雙酶切后體外連接,構(gòu)建酵母重組表達(dá)載體pPIC9K/glu-n,將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/glu-n用限制性內(nèi)切酶SacⅠ(位于5'AOX1區(qū)內(nèi))線性化后,采用電
4、擊法轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115酵母感受態(tài)細(xì)胞,于MD/MM平板上篩選His+Mut+表型的酵母轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過PCR檢測(cè)及G418抗性篩選得到多拷貝整合子,進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)。通過檢測(cè)各轉(zhuǎn)化子每隔24h的蛋白表達(dá)情況來篩選高效表達(dá)目的蛋白的工程菌株。篩選到表達(dá)酶活性最高的菌株4-60,甲醇誘導(dǎo)7d酶活性達(dá)到最高,達(dá)257.379U/mL。
表達(dá)的β-1,3-葡聚糖酶進(jìn)行硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose
5、 Fast Flow陰離子層析獲得了凝膠電泳均一的分子量約為94kDa的β-1,3-葡聚糖酶。表達(dá)β-1,3-葡聚糖酶GLU-N的最適反應(yīng)溫度和pH分別為60℃和5.0,70℃的保溫60min仍具有60%的酶活性;在pH值為4.0~7.0之間保持穩(wěn)定的酶活性。β-1,3-葡聚糖酶對(duì)輪枝鐮孢菌(Fusarium verticillioide)、煙草赤星病菌(Alternaria alternata)的菌絲生長有一定的抑制作用。對(duì)嘴突凸臍蠕
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