嗜熱木聚糖酶的基因克隆、蛋白表達(dá)及突變研究.pdf

1、木聚糖是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的半纖維素的最主要的成分之一，它的徹底降解需要多種酶的參與。而內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶是其中起主要作用的酶，它可以裂解木聚糖的β-1，4糖苷鍵進(jìn)而生成低聚寡糖和木糖。木聚糖酶在工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用非常廣泛。本研究從嗜熱脂肪地芽孢桿菌中，克隆了一個木聚糖酶基因，并將其成功的表達(dá)在大腸桿菌中，且對它的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。同時本研究還利用隨機(jī)突變技術(shù)對木聚糖酶分子進(jìn)行了改良。所取得的具體的研究結(jié)果如下:
　　 1.

2、利用PCR技術(shù)從嗜熱脂肪地芽孢桿菌1A05583克隆出了內(nèi)切-β-1，4-木聚糖酶基因xynA。xynA是由996 bp組成，其中GC的含量為49.5％，編碼331個氨基酸，分子量為38.63 kDa。通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)XynA屬于第10家族的糖苷水解酶。而后將xynA基因克隆到pGEX-6p-1載體上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DE3中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和純化。對XynA的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)XynA的最適pH是6.5。在pH4.5-8.0緩沖液

3、處理過夜后，仍有60％以上的活性，說明XynA是偏中性的木聚糖酶。其次，XynA的最適溫度是65℃，具有較好的熱穩(wěn)定性，當(dāng)它在60℃保溫處理1h后，XynA仍具有80％的活性。Cu2+，Mg2+，Ba2+，Zn2+和Mn2+對酶的活性具有促進(jìn)作用，而Hg2+、Pb2+、SDS和β-巰基乙醇對酶的活性具有強(qiáng)烈的抑制作用。XynA對山毛櫸木聚糖的的Km是1.655 mg/mL，Vmax是765.0μmol/mg·min， kcat是492.

4、5 s-1,kcat/Km是297.6 mL·mg-1s-1。
　　 2.利用易錯PCR技術(shù)和96深孔板高通量篩選體系，以獲得催化效率提高的酶。從9000株突變株中篩選到了兩個突變株1-B8和2-H6。1-B8和2-H6的最適pH分別是7.0和7.5，在pH5.0-10.5的范圍內(nèi)，它們均具有60％以上的酶活，堿耐受性跟野生型相比范圍變廣了。1-B8和2-H6的最適溫度分別是60℃和65℃。跟野生型相比，這兩者的熱穩(wěn)定性均發(fā)生下

5、降。當(dāng)將1-B8在50℃保溫處理1h后，它保持有80％的活性，但在60℃保溫處理1h后，它基本失去活性。當(dāng)將2-H6在60℃保溫處理1h后，2-H6僅具有60％的活性。1-B8對山毛櫸木聚糖的Km是2.0 mg/mL，Vmax是1158.0μmol/mg·min，kcat是745.5 s-1，kcat/Km是372.8mL·mg-1s-1，跟野生型相比催化效率（kcat/Km）提高了25％，2-H6對山毛櫸木聚糖的Km是1.302 mg

6、/mL，Vmax是1137.6μmol/mg-min，kcat是732.3 s-1，kcat/Km是562.4 mL·mg-1s-1，跟野生型相比kcat/Km提高了89％。
　　 3.對1-B8和2-H6進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)他們含有一個相同的突變位點179位的組氨酸。而后利用定點飽和突變技術(shù)將剩余的19種氨基酸引入到這個位點，發(fā)現(xiàn)當(dāng)組氨酸被替換為苯丙氨酸時，它對山毛櫸木聚糖的Km是1.084 mg/mL，Vmax是1734.5μ