擬南芥花藥特異表達(dá)的β-1,3-葡聚糖酶基因功能分析.pdf

1、植物的β-1，3-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.39)是一類重要的病程相關(guān)(PR)蛋白，屬于PR-2家族，負(fù)責(zé)催化水解β-1，3-葡聚糖(β-1，3鏈連接的葡聚糖多聚體)。β-1，3-葡聚糖酶可在病理或相關(guān)的條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生，同時(shí)，還參與了植物體內(nèi)很多生理發(fā)育過(guò)程，如細(xì)胞延長(zhǎng)、分裂，花粉管的萌發(fā)與延伸、果實(shí)的成熟、種子的萌發(fā)以及四分體后期小孢子的釋放等。
　　 在甘藍(lán)型油菜不育材料7365A和可育材料7365B中，利用SSH差減文

2、庫(kù)和反向Northern雜交，得到76個(gè)差異表達(dá)的Unigenes。根據(jù)擬南芥花藥發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中提供的信息，結(jié)合Real-time PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)BnA6和BnMSR66基因在不育材料7365A中受到了明顯的抑制。BnA6和BnMSR66基因都編碼β-1，3-葡聚糖酶，可能參與到花藥發(fā)育中胼胝質(zhì)的降解過(guò)程。
　　 為了鑒定BnA6和Bn MSR66是否直接參與到花藥發(fā)育過(guò)程中胼胝質(zhì)的降解過(guò)程，我們克隆了BnA6和BnMSR66

3、基因在擬南芥中的同源基因(At4g14080和At3g237700)，同時(shí)克隆了擬南芥的另外兩個(gè)β-1，3-葡聚糖酶基因(At4g16260和At3g24330)，將這四個(gè)基因全長(zhǎng)ORF分別融合A9、AMS、MYB103基因的啟動(dòng)子構(gòu)建提前表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥。由于其中三個(gè)基因都含有一個(gè)被認(rèn)為是識(shí)別β-1，3-葡聚糖的糖結(jié)合模塊-X8結(jié)構(gòu)域，我們同時(shí)克隆了沒(méi)有X8結(jié)構(gòu)域的部分ORF，同樣分別融合A9、AMS、MYB103基因的啟動(dòng)子，也構(gòu)

4、建提前表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥。
　　 通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化單株的篩選與鑒定，我們21個(gè)提前表達(dá)載體總共獲得了276株陽(yáng)性苗，其中不育單株52株，大部分為Bn MRS66在擬南芥中的同源基因去除X8結(jié)構(gòu)域的部分ORF提前表達(dá)載體轉(zhuǎn)化所得。無(wú)論融合的是A9還是AMS，或者M(jìn)YB103的啟動(dòng)子，基本都出現(xiàn)了敗育的表型。
　　 對(duì)敗育材料的進(jìn)一步細(xì)胞學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂形成小孢子的過(guò)程中，與野生型幾乎沒(méi)有明顯的差異，但是在小孢子繼

5、續(xù)發(fā)育成為成熟花粉粒的過(guò)程出現(xiàn)異常，相比于野生型材料平整的小孢子外壁，不育材料的小孢子外壁粗糙不平，而且細(xì)胞內(nèi)明顯的液泡化，無(wú)法正常進(jìn)行有絲分裂依次形成雙核、三核花粉粒。
　　 苯胺藍(lán)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化單株和野生型材料四分體時(shí)期，胼胝質(zhì)層存在明顯的差異。轉(zhuǎn)化單株的整個(gè)四分體外周基本檢測(cè)不到胼胝質(zhì)的存在，僅在小孢子與小孢子的間隙能看到少量的胼胝質(zhì)，而野生型材料，我們能夠在整個(gè)四分體周圍與內(nèi)部都檢測(cè)到很強(qiáng)的胼胝質(zhì)信號(hào)。從而，我們可以

6、確定，轉(zhuǎn)化單株之所以出現(xiàn)敗育是因?yàn)榛ㄋ幇l(fā)育過(guò)程中胼胝質(zhì)的提前降解，而胼胝質(zhì)的提前降解直接導(dǎo)致了小孢子無(wú)法正常發(fā)育成為可育的成熟花粉粒。
　　 GUS染色與擬南芥電子表達(dá)譜分析結(jié)果表明，目標(biāo)基因主要在擬南芥花序內(nèi)部幾朵小花(對(duì)應(yīng)花藥發(fā)育的9期、10期和11期)的花藥里表達(dá)，較大的花蕾以及開(kāi)放的花、葉片、葉鞘、莖、根等部位均沒(méi)有表達(dá)。
　　 以上結(jié)果綜合分析可知，花藥特異表達(dá)的β-1，3-葡聚糖酶基因(At3923770)的