新城疫廣西-9的全長測序及Muketeswar疫苗株的病毒拯救.pdf

1、在全球的家禽養(yǎng)殖業(yè)中,新城疫已經(jīng)成為巨大的威脅疫病,1926年首次暴發(fā),至今已造成了巨大的經(jīng)濟損失,已經(jīng)被國際獸醫(yī)局列為A類傳染病。在全世界范圍內(nèi)已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。我國關(guān)于新城疫的報道最早造見于河南,時間為1935年。新城疫暴發(fā)的始作俑者為病毒NDV,目前,國際上通用的毒力測試指標為MDT、ICPI和IVPI,依據(jù)這三個指標的綜合分析,我們可以將NDV分為強毒株、中毒株和弱毒株。NDV屬于負鏈的不分節(jié)段的RNA病毒,歸屬在副粘病毒科

2、的禽副粘病毒屬。全長基因編碼6個功能蛋白,分別為NP、P、M、F、HN和L。其中,與細胞的融合和毒力相關(guān)的主要蛋白是F和HN,也是研究最多的蛋白。
　　反向遺傳學目前已經(jīng)廣泛運用到NDV的分子研究中了,早在1999年就已經(jīng)報道了NDV病毒的拯救成功案例。實驗研究的是低毒力的LaSota,期間是對P基因的剪接位點進行了修飾。嵌合重組的NDV的產(chǎn)生也相繼被報道。病毒拯救成功的條件是:全長cDNA的完整克隆、輔助質(zhì)粒NP、P和L的成功構(gòu)

3、建以及可以穩(wěn)定表達T7聚合酶的細胞體系。NDV的復制中,輔助質(zhì)粒的作用是不可或缺的,螺旋狀的核衣殼是RNA復制的主要模板,而核衣殼蛋白NP和基因組RNA共同構(gòu)成了核心結(jié)構(gòu),磷蛋白P和大蛋白L附著在核心結(jié)構(gòu)上,這樣共同組成了轉(zhuǎn)錄復制復合物,這也是復制的關(guān)鍵所在。
　　本實驗中,為了研究廣西-9毒株是否與其他的毒株存在著重組情況,我們的工作就是為此做好基礎(chǔ),將此毒株的全長進行測序。由于其基因組太長,我們需要分段進行測序,經(jīng)過RT-PC

4、R得到8條DNA序列,送往華大進行測序,成功得到廣西-9的全長序列。
　　實驗室已經(jīng)有Mukeswar的全長cDNA克隆質(zhì)粒,它的起始位置添加了T7啟動子序列,末端添加了丁肝核酶和T7終止子序列,還有可以表達T7聚合酶的輔助質(zhì)粒,本研究中,我們將NP、P克隆到真核表達質(zhì)粒pCDNA3.0上,L基因分段克隆到重新構(gòu)建的新的表達載體pMC18-CMV上。后將五種質(zhì)粒成功共轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞中引起細胞病變,經(jīng)RT-PCR鑒定及序列比