藍(lán)舌病病毒四種檢測技術(shù)比較研究.pdf

1、藍(lán)舌病(Bluetongue disease，BT)是由庫蠓傳播的反芻動物急性病毒性傳染病，其病原藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)為呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Obivirus)成員。藍(lán)舌病的暴發(fā)對國際貿(mào)易中的動物和動物產(chǎn)品產(chǎn)生嚴(yán)重的社會經(jīng)濟(jì)后果，但世界各國尚未研制出十分有效的疫苗，且無有效的防治措施。因此，使用準(zhǔn)確的早期檢測手段，及時隔離和處理已感動物，是減少經(jīng)濟(jì)損失的關(guān)鍵。在這種情況下，加強(qiáng)

2、我國的藍(lán)舌病病原學(xué)監(jiān)測工作顯得尤為重要。
　　 目前，本實驗室建立的藍(lán)舌病病毒核酸實時熒光RT-PCR檢測體系、核酸RT-PCR檢測體系和抗原捕獲ELISA檢測體系均已完成靈敏度、特異性、重復(fù)性和符合率等方面評價。本研究的主要內(nèi)容是使用上述BTV檢測體系及OIE標(biāo)準(zhǔn)巢式RT-PCR檢測方法針對BTV全病毒進(jìn)行平行檢測，然后對檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析。通過以上研究分析，旨在為臨床樣品檢測提供可信的實驗指導(dǎo)依據(jù)，便于對藍(lán)舌病做出及時有效

3、地診斷。
　　 一、BTV-5的培養(yǎng)
　　 將本實驗室保存的BTV-5接毒BHK-21細(xì)胞，通過細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)、純化病毒形態(tài)觀察和本實驗室研制的藍(lán)舌病病毒核酸RT-PCR檢測體系對培養(yǎng)得到的BTV-5進(jìn)行鑒定。取BTV-5毒液進(jìn)行TCID50測定，結(jié)果為10-2.83/0.1mL。使用DMEM培養(yǎng)液將毒液進(jìn)行倍比稀釋：1∶22～1∶221，將其作為BTV陽性檢測樣品。利用本實驗室保存的鹿流行性出血熱病毒(Epiz

4、ootic hemorrhagic disease virus，EHDV)-5標(biāo)準(zhǔn)參考株作為特異性參考品。
　　 二、四種BTV檢測體系對BTV-5全病毒檢測的評價
　　 對藍(lán)舌病病病毒核酸實時熒光RT-PCR檢測體系、核酸RT-PCR檢測體系、OIE標(biāo)準(zhǔn)巢式RT-PCR檢測方法和抗原捕獲ELISA檢測體系進(jìn)行特異性和靈敏度評價。試驗結(jié)果表明，(1)藍(lán)舌病病毒核酸實時熒光RT-PCR檢測體系特異性好，與親緣最近的EHDV

5、-5無交叉反應(yīng)，并且對BTV-5全病毒的檢出限為3.3TCID50/mL。(2)藍(lán)舌病病毒核酸RT-PCR檢測體系特異性好，與親緣最近的EHDV-5無交叉反應(yīng)，并且對BTV-5全病毒的檢出限為3.3TCID50/mL。(3)OIE標(biāo)準(zhǔn)巢式RT-PCR檢測方法特異性好，與親緣最近的EHDV-5無交叉反應(yīng)，并且對BTV-5全病毒的檢出限為6.4×10-3TCID50/mL。(4)抗原捕獲ELISA檢測體系特異性好，與親緣最近的EHDV-5無

6、交叉反應(yīng)，并且對BTV-5全病毒的檢出限為211.3TCID50/mL。
　　 三、各BTV檢測體系比較評價
　　 將各項檢測數(shù)據(jù)匯總，對各檢測體系從特異性、靈敏度、實驗耗時和儀器使用情況等方面進(jìn)行評價。結(jié)果表明，(1)在特異性方面，4種檢測體系與BTV親緣關(guān)系最近的EHDV-5無交叉反應(yīng)，特異性好。(2)在靈敏度方面，3種核酸檢測體系(核酸實時熒光RT-PCR檢測體系、核酸RT-PCR檢測體系、OIE標(biāo)準(zhǔn)巢式RT-PC

7、R檢測方法)均優(yōu)于抗原捕獲ELISA檢測體系，檢出限間的差距均在2個數(shù)量級以上。(3)在實驗耗時和儀器使用方面，3種核酸檢測體系(核酸實時熒光RT-PCR檢測體系、核酸RT-PCR檢測體系、OIE標(biāo)準(zhǔn)巢式RT-PCR檢測方法)與抗原捕獲ELISA檢測體系相比，檢測耗時長、使用的儀器種類多、對實驗室的設(shè)備條件要求較高。(4)核酸實時熒光RT-PCR檢測體系較其他2種核酸檢測體系操作簡便，不需繁瑣的電泳，使用熒光定量檢測儀即可完成從PCR擴(kuò)