金黃色葡萄球菌RAP與TRAP蛋白的基因表達(dá)及免疫保護(hù)作用.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Saureus)是一種重要的致病菌，可以引起人和動(dòng)物的多種疾病，其主要致病物質(zhì)是毒素和酶。在S.aureus對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的中后期，細(xì)菌開(kāi)始分泌RAP，RAP通過(guò)作用于膜表面的TRAP調(diào)控S.aureus各種毒素和酶的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生致病作用。但目前將RAP和TRAP免疫動(dòng)物能否產(chǎn)生良好免疫保護(hù)作用仍不十分清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)用原核表達(dá)的RAP和TRAP分別免疫小鼠，研究它們的免疫保護(hù)作用。 本課題采用PCR方法擴(kuò)增

2、金黃色葡萄球菌毒力調(diào)控蛋白R(shí)AP基因和TRAP基因，將這兩條基因片段純化回收，分別與pMD18-T載體連接，并轉(zhuǎn)化XLl-Blue大腸桿菌。經(jīng)PCR.和BamHI、Sall雙酶切鑒定后，將所獲得的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pMD-rap和pMD-trap。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步將兩個(gè)陽(yáng)性克隆和pQE-30空載體用BamHI、SalI雙酶切后回收，將從pMD-rap和pMD-trap上酶切獲得的rap和trap片段分別與雙酶切后的pQE-30載體連接，構(gòu)建出

3、重組表達(dá)載體pQE-rap和pQE-trap，并分別轉(zhuǎn)化XLl-Blue大腸桿菌。分別將pQE-rap和pQE-trap進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Genbank中公布的序列相比，rap的同源性在99％以上，而trap的同源性為100％，編碼的氨基酸序列的同源性為99.8％和100％。含有pQE-rap和pQE-trap的重組菌XLl-Blue經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并用抗Histidine單抗進(jìn)行Western Blot分析

4、，結(jié)果證明重組菌表達(dá)出分子量約39kDa和22kDa的蛋白質(zhì)，二者分子量大小與DNAStar分析結(jié)果也相符，表明目的蛋白基因成功獲得表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，用MagneHis<'TM>蛋白純化系統(tǒng)對(duì)表達(dá)的RAP和TRAP蛋白進(jìn)行純化，用弗氏佐劑乳化后免疫小鼠，每種蛋白分為10μg、20μg和50μg三個(gè)劑量，同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照組。首次免疫后四周進(jìn)行二次免疫，再過(guò)一周對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒，并觀察13天。結(jié)果與對(duì)照組相比，至第13天，RAP和TRAP最