六種蟲媒病毒蛋白芯片檢測方法的建立.pdf

1、蟲媒病毒(Arthropod viruses)是一大類通過嗜血節(jié)肢動(dòng)物傳播的病毒,通常引起人類發(fā)熱性和腦炎樣疾病,流行病學(xué)呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性與地域性,多爆發(fā)于蚊蟲、蜱類等大量孽生的夏秋季節(jié),嚴(yán)重危害人類健康與公共安全。由于一些蟲媒病毒還能通過氣溶膠途徑傳播,也是重要的病毒性生物戰(zhàn)劑。蟲媒病毒包括披膜病毒科、布亞病毒科、黃病毒科在內(nèi)的多種病毒,其中以黃病毒屬病毒感染的危害最大,在我國境內(nèi)主要流行的蟲媒病毒病包括流行性乙型腦炎、森林腦炎、登革

2、熱、新疆出血熱,多是由黃病毒屬病毒感染所致的傳染病。蟲媒病毒的致病機(jī)制尚不清楚,目前亦無有效的疫苗和抗病毒藥物。早期、快速鑒定病原體是有效預(yù)防和控制蟲媒病毒病的基礎(chǔ)。
　　由于蟲媒病毒感染的臨床表現(xiàn)與流行病學(xué)特點(diǎn)相似,因此,準(zhǔn)確檢測與鑒定病原體顯得尤為重要。目前,對(duì)于蟲媒病毒抗體的臨床檢測技術(shù)仍以傳統(tǒng)的免疫熒光(IFA)和ELISA檢測為主,一次反應(yīng)只能檢測一種病原體。本研究以黃病毒屬的流行性乙型腦炎病毒(JEV)、森林腦炎病毒(

3、TBEV)、登革病毒(DENV)、西尼羅病毒(WNV)和甲病毒屬的西部馬腦炎病毒(WEEV)、東部馬腦炎病毒(EEEV)為研究對(duì)象,建立能同時(shí)檢測六種蟲媒病毒抗體的蛋白芯片檢測方法,為蟲媒病毒病的臨床診斷提供新的手段。檢測原理是將病毒特異性診斷抗原作為捕獲抗原點(diǎn)樣制備蛋白芯片,利用抗原抗體反應(yīng)的原理檢測血清中的病毒特異性抗體,再通過與熒光標(biāo)記的二抗反應(yīng)進(jìn)行結(jié)果的分析與判定。目前,國內(nèi)外尚未見到蛋白芯片同時(shí)檢測多種蟲媒病毒抗體的報(bào)道。

4、r>　　本課題的主要研究結(jié)果如下:
　　1、蟲媒病毒候選診斷抗原的表達(dá)、純化及鑒定
　　本課題選擇含有誘導(dǎo)中和抗體的抗原表位的重組抗原作為蛋白芯片檢測技術(shù)的候選診斷抗原。研究表明,黃病毒屬病毒的EDⅢ蛋白只包含誘導(dǎo)中和抗體的型與亞型特異性抗原表位,不含有誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉反應(yīng)抗體的抗原表位,NS1蛋白可誘導(dǎo)中和抗體,是目前疫苗研究與病毒免疫診斷的研究熱點(diǎn),PrM蛋白和NS3蛋白在黃病毒屬中保守穩(wěn)定,具有良好免疫原性,這兩個(gè)蛋白均有

5、作為病毒診斷抗原的報(bào)道。甲病毒屬的E1蛋白含有中和性抗原決定簇,至少有4個(gè)非重疊的抗原表位,具有良好的免疫原性,是甲病毒屬病毒免疫學(xué)檢測的重要抗原之一。依據(jù)國內(nèi)外對(duì)這兩類病毒診斷抗原的研究進(jìn)展,并結(jié)合我國病毒流行株的特點(diǎn),本課題使用DNAstar與Primer5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并添加適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn),共設(shè)計(jì)了針對(duì)TBEV、JEV、DENV1、DENV2、DENV3、DENV4、YFV、WEE、EEE、WNV的17對(duì)PCR擴(kuò)增引物。通過構(gòu)建

6、并鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒,在大腸桿菌中共表達(dá)了17個(gè)重組抗原,并采用鎳離子親和層析的方法進(jìn)行了抗原的純化。另外,利用滅活病毒免疫大白兔制備動(dòng)物免疫血清,在完成其效價(jià)及特異性鑒定的基礎(chǔ)上,采用ELISA方法通過動(dòng)物免疫血清鑒定所表達(dá)的重組抗原的檢測特異性,共獲得12個(gè)具有良好特異性的診斷抗原,為進(jìn)一步建立蟲媒病毒蛋白芯片檢測方法奠定了基礎(chǔ)。
　　2、蛋白芯片檢測方法的建立及條件優(yōu)化
　　采用SpotArrayTM24點(diǎn)樣儀將純化后的

7、17個(gè)候選診斷抗原作為捕獲抗原點(diǎn)制于晶芯高分子三維基片上制備蛋白芯片,以兔IgG作為陽性對(duì)照,以含15％甘油的PBS為陰性對(duì)照,每個(gè)樣本重復(fù)3點(diǎn),點(diǎn)樣后,玻片室溫下自然風(fēng)干4h。首先采用兔免疫血清與蛋白芯片進(jìn)行反應(yīng),篩選可用于蛋白芯片檢測方法的特異性良好的診斷抗原。通過分析,共篩選出12個(gè)特異性較好的重組抗原,與ELISA法篩選的結(jié)果一致,表明將不同病毒的診斷抗原在一張芯片上反應(yīng)并不影響彼此的檢測特異性。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行蛋白芯片檢測條件

8、的優(yōu)化,優(yōu)化結(jié)果顯示,抗原點(diǎn)樣濃度在0.125～0.6mg/ml之間可獲得良好的檢測特異性,血清檢測范圍可達(dá)到1:100～1:1000。蛋白芯片的最佳反應(yīng)條件芯片封閉時(shí)間為2h、Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG使用效價(jià)為1:1000、第二抗體反應(yīng)時(shí)間為45min,蛋白樣本稀釋液中甘油的濃度為15%。在條件優(yōu)化之后,再次用兔免疫血清進(jìn)行蛋白芯片的驗(yàn)證,證明用優(yōu)化后的反應(yīng)條件及篩選到的12個(gè)診斷抗原可獲得良好的檢測特異性。
　　3.蛋白芯片檢

9、測方法的考核與驗(yàn)證
　　建立蟲媒病毒蛋白芯片檢測方法的最終目的是將其應(yīng)用于蟲媒病毒感染患者的臨床診斷,為蟲媒傳染病的診斷和治療提供重要的病原學(xué)依據(jù)。因此,在建立蛋白芯片檢測方法之后,采用臨床血清標(biāo)本對(duì)芯片的實(shí)際檢測效果進(jìn)行了考核與驗(yàn)證。共收集了33份疑似森林腦炎病毒感染血清、8份疑似乙型腦炎病毒感染血清、22份疑似登革病毒感染血清,以及20份正常人血清作為陰性對(duì)照。首先,采用以滅活全病毒作為抗原的IFA方法對(duì)樣本進(jìn)行了檢測,然后用

10、篩選出的12個(gè)診斷抗原作為包被或捕獲抗原,采用ELISA方法和優(yōu)化后的蛋白芯片方法進(jìn)行了平行檢測,以比較其檢測效果。在33份疑似森林腦炎病毒感染血清中,IFA方法檢測結(jié)果為21份IgG抗體陽性,23份IgM抗體陽性;在重組抗原的平行檢測中,ELISA和蛋白芯片的檢測結(jié)果均為16份IgG抗體陽性、17份IgM抗體陽性,檢測符合率達(dá)到100%;對(duì)8份疑似乙型腦炎病毒感染血清的檢測中,IFA檢測到8份IgG抗體陽性,6份IgM抗體陽性,ELI

11、SA法檢測到4份IgG抗體陽性、5份IgM抗體陽性,而蛋白芯片法檢測到5份IgG抗體陽性和5份IgM抗體陽性,檢出率稍高于ELISA法;對(duì)22份疑似登革病毒感染血清的檢測結(jié)果為:ELISA檢測13份IgG抗體陽性,15份IgM抗體陽性,而蛋白芯片法檢出14份IgG抗體陽性,15份IgM抗體陽性,檢出率稍高于ELISA法。ELISA與蛋白芯片方法檢測出的陽性血清標(biāo)本編號(hào)一致,而且均在IFA檢測的陽性標(biāo)本范圍中。經(jīng)Kappa檢驗(yàn)后,證明蛋白

12、芯片與ELISA具有良好的一致性。正常人血清樣本檢測結(jié)果均為陰性。蛋白芯片法在檢測出DENV抗體陽性的基礎(chǔ)上,可以同時(shí)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行血清學(xué)分型。以重組抗原為捕獲抗原的蛋白芯片與ELISA法的陽性檢出率均低于以全病毒為抗原的IFA方法。為提高蛋白芯片方法的敏感性,以TBEV為例,用EDⅢ與NS1抗原組合作為診斷抗原進(jìn)行檢測,共檢出18份IgG陽性血清和18份TBEVIgM陽性血清,比單一TBE-EDⅢ抗原多檢出IgG抗體陽性標(biāo)本2份,IgM陽

13、性標(biāo)本1份,證明應(yīng)用組合抗原可提高抗體陽性標(biāo)本的檢出率。
　　通過對(duì)診斷抗原的鑒定與篩選以及對(duì)蛋白芯片檢測條件的優(yōu)化,本研究建立的6種蟲媒病毒蛋白芯片檢測方法獲得了較好的檢測特異性與敏感性,對(duì)臨床血清標(biāo)本的檢測特異性達(dá)到100%,敏感性稍高于傳統(tǒng)的ELISA法。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明,采用組合的診斷抗原,可以提高蛋白芯片的陽性檢出率。與傳統(tǒng)的IFA和ELISA抗體檢測方法相比,蛋白芯片除具有檢測通量高的優(yōu)勢外,還可以節(jié)約檢測成本、縮