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1、本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GenBank發(fā)表的PRRSV北美洲分離株(VR-2332)毒株的基因序列,利用Oligo和Primer5.0軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增GP5蛋白基因的引物。從疑似藍(lán)耳病的豬內(nèi)分離到PRRSV,在Marc-145細(xì)胞中盲傳5-6代,出現(xiàn)較為明顯的細(xì)胞病變,收獲病毒液將其反復(fù)凍融3次進(jìn)行病毒RNA的提取,反轉(zhuǎn)錄PCR,成功的擴(kuò)增出全長(zhǎng)為603個(gè)堿基的GP5基因片段。序列比較表明與已發(fā)表的VR-2332病毒毒株的GP5蛋白基因序列的同源率
2、為91.5%;經(jīng)BLAST搜索,擴(kuò)增的GP5基因與CH-1α同源性最高,為99.2%。該毒株被命名為HH08。
通過對(duì)PRRSVHH08株GP5基因序列分析,設(shè)計(jì)2對(duì)引物,通過PCR擴(kuò)增獲得了不含信號(hào)肽和跨膜功能區(qū)的GP5基因片段,長(zhǎng)度分別為121bp和248bp。應(yīng)用酶切位點(diǎn)相連構(gòu)建融合基因技術(shù),將兩段基因亞克隆到原核表達(dá)載體中獲得了重組質(zhì)粒pET-GP5。構(gòu)建的重組質(zhì)粒在E.coliRosetta中進(jìn)行原核表達(dá)。SDS
3、-PAGE結(jié)果表明有大小約為18Ku的蛋白表達(dá),與預(yù)計(jì)大小相符。Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示表達(dá)的蛋白能被天然PRRSV陽性豬血清所識(shí)別,同時(shí)此蛋白抑制PRRSV對(duì)Marc-145細(xì)胞的感染。將重組蛋白免疫新西蘭白兔,制備多抗,經(jīng)間接ELISA結(jié)果顯示多抗血清效價(jià)可達(dá)217。將PRRSVHH08包被ELISA檢測(cè)多抗血清的特異性,發(fā)現(xiàn)血清特異性較好,GP5蛋白血清具有抗中和病毒的活性,間接免疫熒光結(jié)果顯示多抗血清能夠用于PRRS
4、V的特異性檢測(cè)。
利用噬菌體隨機(jī)十二肽庫,以GP5重組融合蛋白為靶分子,對(duì)其進(jìn)行了四輪生物淘選。對(duì)第四輪洗脫物隨機(jī)選出的20個(gè)噬菌體單克隆的核苷酸序列測(cè)定及多肽序列的推導(dǎo)結(jié)果表明,經(jīng)過對(duì)靶分子的四輪篩選后,最終篩選出8種高親和力的十二肽。將最高親和力的2個(gè)序列進(jìn)行合成,分別為KHMHWHPPALNT(K);HWGNHSKSHPQR(H)。競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法對(duì)合成多肽的檢測(cè)結(jié)果說明多肽K、H均能與GP5重組蛋白結(jié)合。病毒抑制
5、試驗(yàn)表明所篩選出的多肽具有良好的生物活性。
為了檢測(cè)多肽體內(nèi)的抗病毒活性,本實(shí)驗(yàn)以BALB/c小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物,進(jìn)行免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。將小鼠分成5組,即V+K組(病毒加K噬菌體組)、V+H組(病毒加H噬菌體組)、V+S組(病毒加對(duì)照S噬菌體組)、V組(病毒加PBS組)和C組(空白對(duì)照組)。首免PRRSVHH08株,24h后分別免疫K、H、S噬菌體,免疫后在第7d、14d、21d、28d進(jìn)行血液采集,ELISA方法檢測(cè)小鼠血清樣本中
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