豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白親和肽篩選與鑒定.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GenBank發(fā)表的PRRSV北美洲分離株（VR-2332）毒株的基因序列，利用Oligo和Primer5.0軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增GP5蛋白基因的引物。從疑似藍(lán)耳病的豬內(nèi)分離到PRRSV，在Marc-145細(xì)胞中盲傳5-6代，出現(xiàn)較為明顯的細(xì)胞病變，收獲病毒液將其反復(fù)凍融3次進(jìn)行病毒RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄PCR，成功的擴(kuò)增出全長(zhǎng)為603個(gè)堿基的GP5基因片段。序列比較表明與已發(fā)表的VR-2332病毒毒株的GP5蛋白基因序列的同源率

2、為91.5％；經(jīng)BLAST搜索，擴(kuò)增的GP5基因與CH-1α同源性最高，為99.2％。該毒株被命名為HH08。
　　 通過對(duì)PRRSVHH08株GP5基因序列分析，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，通過PCR擴(kuò)增獲得了不含信號(hào)肽和跨膜功能區(qū)的GP5基因片段，長(zhǎng)度分別為121bp和248bp。應(yīng)用酶切位點(diǎn)相連構(gòu)建融合基因技術(shù)，將兩段基因亞克隆到原核表達(dá)載體中獲得了重組質(zhì)粒pET-GP5。構(gòu)建的重組質(zhì)粒在E.coliRosetta中進(jìn)行原核表達(dá)。SDS

3、-PAGE結(jié)果表明有大小約為18Ku的蛋白表達(dá)，與預(yù)計(jì)大小相符。Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示表達(dá)的蛋白能被天然PRRSV陽性豬血清所識(shí)別，同時(shí)此蛋白抑制PRRSV對(duì)Marc-145細(xì)胞的感染。將重組蛋白免疫新西蘭白兔，制備多抗，經(jīng)間接ELISA結(jié)果顯示多抗血清效價(jià)可達(dá)217。將PRRSVHH08包被ELISA檢測(cè)多抗血清的特異性，發(fā)現(xiàn)血清特異性較好，GP5蛋白血清具有抗中和病毒的活性，間接免疫熒光結(jié)果顯示多抗血清能夠用于PRRS

4、V的特異性檢測(cè)。
　　 利用噬菌體隨機(jī)十二肽庫，以GP5重組融合蛋白為靶分子，對(duì)其進(jìn)行了四輪生物淘選。對(duì)第四輪洗脫物隨機(jī)選出的20個(gè)噬菌體單克隆的核苷酸序列測(cè)定及多肽序列的推導(dǎo)結(jié)果表明，經(jīng)過對(duì)靶分子的四輪篩選后，最終篩選出8種高親和力的十二肽。將最高親和力的2個(gè)序列進(jìn)行合成，分別為KHMHWHPPALNT（K）；HWGNHSKSHPQR（H）。競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法對(duì)合成多肽的檢測(cè)結(jié)果說明多肽K、H均能與GP5重組蛋白結(jié)合。病毒抑制

5、試驗(yàn)表明所篩選出的多肽具有良好的生物活性。
　　 為了檢測(cè)多肽體內(nèi)的抗病毒活性，本實(shí)驗(yàn)以BALB/c小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。將小鼠分成5組，即V+K組（病毒加K噬菌體組）、V+H組（病毒加H噬菌體組）、V+S組（病毒加對(duì)照S噬菌體組）、V組（病毒加PBS組）和C組（空白對(duì)照組）。首免PRRSVHH08株，24h后分別免疫K、H、S噬菌體，免疫后在第7d、14d、21d、28d進(jìn)行血液采集，ELISA方法檢測(cè)小鼠血清樣本中