瀕危植物青島百合種質(zhì)的超低溫保存技術(shù)的研究及遺傳穩(wěn)定性分析.pdf

1、種質(zhì)資源保存除了原生境、異生境、種子、組培苗等常規(guī)保存方法以外，超低溫保存因?yàn)槠浔４鏁r間長久和經(jīng)濟(jì)，越來越受到人們的關(guān)注。青島百合是瀕臨滅絕的物種資源，為長期保存這一資源，本文對青島百合的組織培養(yǎng)和超低溫保存體系進(jìn)行了初步研究。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1.青島百合的離體快速繁殖體系的建立。
　　 以青島百合及麝香百合的鱗片、莖尖、葉片為實(shí)驗(yàn)材料，研究了外植體的放置方式、鱗片及鱗莖的不同部位、不同的激素濃

2、度及活性炭濃度對百合再分化的影響，成功建立了青島百合和麝香百合的高頻再生體系。兩種百合的最佳外植體部位為中層鱗片的基部，放置方式為凸面接觸培養(yǎng)基，青島百合的再生培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.2mg/L，麝香百合的最佳再生培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1 mg/L，兩個品種的百合最高再生率均可達(dá)到100％。利用莖尖和葉片進(jìn)行探究，均可得到再生植株。
　　 2.青島百合的玻璃化超低溫保存方法的建立

3、。
　　 經(jīng)過實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:預(yù)培養(yǎng)時間、預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基、玻璃化脫水以及凍后處理對百合莖尖的再生率都有很大的影響。我們摸索出玻璃化法保存青島百合莖尖的優(yōu)化程序?yàn)?2-3mm的莖尖在MS為基本培養(yǎng)基的100g/L海藻糖+1mg/LABA的培養(yǎng)基上4℃條件下培養(yǎng)3天，用loading液在25℃下處理20min后用PVS2在0℃條件下處理60min，重新裝入新的PVS2溶液后直接放入液氮中，保存1h之上后取出38℃快速化凍2min，用洗液

4、MS+1.2mol/L蔗糖清洗2次，每次10min，轉(zhuǎn)接至恢復(fù)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)7天后，光照培養(yǎng)，約20-30天后便可見有恢復(fù)生長，再生率可達(dá)到83.3％，而且莖尖不經(jīng)過愈傷組織直接再生。
　　 3.青島百合的包埋-玻璃化超低溫保存方法的優(yōu)化。
　　 切取直徑1-2mm大小的青島百合的莖尖，在MS基本培養(yǎng)基上添加0.4mol/L蔗糖、1mg/LABA4℃進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)3天后進(jìn)行莖尖的包埋，包埋液為含有0.4mol/L蔗糖和2mo

5、l/L的甘油的6％褐藻酸鈉。包埋后在超凈臺內(nèi)干燥1h，用PVS2在0℃進(jìn)行玻璃化脫水1h，換取新鮮的PVS2后直接放入液氮保存1h以上后，38℃快速化凍2min后利用去裝載液去裝載2次，每次10min，利用解剖刀劃破膠球后取出莖尖并轉(zhuǎn)接至恢復(fù)培養(yǎng)基MS+6-BA0.5mg/L+GA30.5mg/L+NAA0.1mg/L上進(jìn)行暗培養(yǎng)，7d后用TTC檢測存活率可達(dá)到70％。
　　 4.再生植株的形態(tài)觀察及SSR分析。