水稻tls基因啟動子研究.pdf

1、幾年前，在篩選明恢63/Bt轉(zhuǎn)化系時獲得了一株低結(jié)實率突變體。之后，利用TAIL-PCR技術(shù)對該突變體進(jìn)行了插入位點分析，結(jié)果顯示；由兩個拷貝組成的外源Bt基因大片段的插入位點是位于水稻第10染色體的短臂靠近著絲點的位置上；進(jìn)一步的序列比對分析證實該外源Bt基因大片段是插入在一個功能未知的基因的啟動子序列之中。該突變體現(xiàn)已定名為tls(Temperature-regulated Low Seed-settingrate)突變體，相應(yīng)的基

2、因被命名為tls基因。
　　 生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因的啟動子序列中包含19個高溫(HeatShockElement，HSE)和兩個干旱、低溫和鹽脅迫響應(yīng)元件(Dehydration，low-temperature，and saltstress Responsive Element，DRE)，外源基因的插入，使其中的9個高溫HSE和1個DRE響應(yīng)元件被隔開，并因此影響其對溫度的反應(yīng)能力，以至受到溫度脅迫時其結(jié)實率下降。為了弄清t

3、ls啟動子的分子和表達(dá)特征，我們用PCR方法擴(kuò)增了tls基因啟動子序列，并將其按HSE響應(yīng)元件數(shù)目(4、10、11、15和19個)的多少截短成不同長度的片段后分別進(jìn)行克隆，然后利用這些片段構(gòu)建了5種表達(dá)質(zhì)粒pH4，pH10，pH11，pH15和pH19，利用這些表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化粳稻品種日本晴，篩選得到足夠數(shù)量的陽性轉(zhuǎn)化體用于啟動子表達(dá)活性和模式分析。
　　 利用半定量RT-PCR進(jìn)行的基礎(chǔ)表達(dá)分析結(jié)果表明：野生型和突變型啟動子能

4、驅(qū)動tls基因在根、莖、葉和花中表達(dá)，但兩者的逆轉(zhuǎn)錄本在雌蕊上存在質(zhì)的差異，即野生型有表達(dá)，突變型沒有或僅有痕量表達(dá)；它們在根系上也存在明顯差異，但表達(dá)趨勢與雌蕊上的表達(dá)趨勢剛好相反。
　　 當(dāng)受到高溫脅迫后，野生型和突變型啟動子的表達(dá)都明顯上調(diào)，但后者的上調(diào)幅度比前者更大；低溫脅迫對兩個啟動子的上調(diào)作用有限，對野生型的影響直到第4天才能觀察到，但對突變型的影響于第2天即可見。
　　 與溫度脅迫反應(yīng)結(jié)果相反，鹽脅迫和模擬

5、干旱處理后野生型和突變型啟動子的表達(dá)總體上呈下調(diào)表達(dá)，且突變體和野生型以及鹽脅迫和模擬干旱處理的趨勢都一致，其不同時間取樣點的動態(tài)變化特征是：顯著下調(diào)(6h)-不完全的回復(fù)(12h)-輕微下調(diào)(48h)-再輕微下調(diào)(72h))。但在總體下調(diào)的程度上是野生型比突變體重和鹽脅迫比模擬干旱處理的重。
　　 利用GUS組織化學(xué)和熒光定量分析對截短型和全長tls啟動子的研究結(jié)果顯示：(1)截短型啟動子H4、H10不能有效驅(qū)動gus基因在轉(zhuǎn)